Purificação de peptídeos: uma técnica baseada em RP-HPLC para extrair peptídeos de lisados de proteínas digeridas

Para isolar e purificar os peptídeos, comece com uma suspensão de lisado de proteína contendo uma mistura de peptídeos digeridos.

Trate a mistura com ácido trifluoroacético ou reagente à base de TFA. Este reagente aniônico ou carregado negativamente forma um complexo de pares iônicos com resíduos básicos ou carregados positivamente nos peptídeos, mascarando assim sua carga e melhorando a hidrofobicidade do peptídeo.

Agora, monte uma coluna de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa, ou RP-HPLC, contendo uma fase estacionária porosa à base de sílica, imobilizada com ligantes hidrofóbicos não polares. Adicione um tampão de equilíbrio compatível com peptídeos à coluna para preparar a fase estacionária antes da aplicação da amostra.

Agora, coloque a amostra acidificada na coluna. Dentro da coluna, os peptídeos hidrofóbicos adsorvem seletivamente aos ligantes hidrofóbicos da fase estacionária. Passe um buffer de lavagem pela coluna para eluir quaisquer partículas não ligadas ou indesejadas.

Em seguida, passe um tampão de eluição orgânico menos polar, com alta hidrofobicidade, através da coluna. Devido à sua afinidade seletiva com o tampão de eluição, os peptídeos ligado