JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 4:50 min • April 30th, 2023
A fosforilação de resíduos de aminoácidos específicos, como a tirosina, gera fosfopeptídeos que desempenham papéis críticos na regulação de várias vias de sinalização celular. Estudá-los permite a identificação de potenciais biomarcadores para a terapia do câncer.
Para isolar os fosfopeptídeos, comece com um pó liofilizado de digeridos peptídicos purificados extraídos do tecido cancerígeno. Ressuspenda o pó em um tampão adequado para preparar uma suspensão peptídica uniforme. Mantenha um pH neutro para garantir a estabilidade do peptídeo.
Preparar uma pasta constituída por esferas de hidrogel conjugadas com anticorpos antifosfopeptídeos específicos no tampão pretendido. Adicione a pasta de esferas à suspensão de peptídeos. Os anticorpos imobilizados nas esferas reconhecem e se ligam aos seus resíduos específicos de aminoácidos fosforilados dentro dos fosfopeptídeos, formando complexos.
Centrifugar a mistura para recolher os complexos fosfopeptídeo-grânulos no sedimento. Remover o sobrenadante que contém péptidos não ligados ou fosfopeptídeos não específicos. Adicione um tampão de eluição de pH baixo adequado aos complexos e incube. O baixo pH enfraquece a interação entre os resíduos de fosfopeptídeos e os complexos anticorpo-grânulo, liberando os peptídeos na solução.
Transfira a mistura para um cartucho de filtro pré-montado. Centrifugue para eluir os fosfopeptídeos libertados para o tubo de recolha. Concentrar a amostra a vácuo a uma temperatura elevada para remover o tampão e obter um sedimento seco concentrado de fosfopeptídeos puros.
Ressuspenda o pó liofilizado com 0,5 mililitros de imunoprecipitação gelada, ou IP, tampão de ligação em cada fração. Transferir o volume de ressuspensão de 0,5 mililitros da segunda fração para o tubo com a primeira fração e guardar a ponta da pipeta. Use mais 0,5 mililitros de tampão IP para enxaguar cada tubo de liofilização antes de transferir o conteúdo para o criotubo. Em seguida, repita o enxágue usando 2 mililitros de tampão IP.
Depois de usar o P200 com uma ponta cortada para transferir o estoque de 0,5 miligramas por mililitro de pasta de esferas de anticorpos para o tubo de microfífugas, adicione 450 microlitros de tampão de ligação IP gelado para lavar 50 microlitros de pasta de esferas de anticorpos 4G10 e 25 microlitros de pasta de esferas de anticorpos 27B10.4 em um tubo de microfífugas. Centrifugue o tubo a 100 x g e 4 graus Celsius por 1 minuto. Depois de aspirar o sobrenadante, adicione um volume igual à pasta original do tampão de ligação IP para ressuspender os grânulos. Adicione grânulos pY pré-lavados à solução de amostra ressuspensa nos tubos criogênicos com tampa de rosca. Em seguida, incube-os a 4 graus Celsius em um rotador de ponta a ponta durante a noite. Depois de girar as contas, guarde o sobrenadante, que será usado para enriquecer os peptídeos pST.
Em seguida, use 300 microlitros de tampão de ligação IP para ressuspender os grânulos e transferi-los para um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros. Gire as amostras a 100 x g e 4 graus Celsius por 1 minuto. Em seguida, com 500 microlitros de tampão de ligação IP, lave as contas três vezes. Lave as esferas quatro vezes com 450 microlitros de bicarbonato de amônio 25 mM, pH 7,5. Mergulhe uma ponta de carregamento de gel ligeiramente abaixo da superfície do cordão e aspire completamente o sobrenadante. Adicione quatro vezes o volume do cordão de 0,1% de TFA aos grânulos.
Em seguida, misture-os bem e incube o tubo em um termomixer a 1.000 rpm e 37 graus Celsius por 15 minutos. Transfira a ressuspensão para um filtro de centrifugação de 0,2 micrômetro e centrifugue o filtro a 850 x g por 1 minuto. Depois de transferir a eluição para um tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas, concentre o eluído a vácuo até a secura a 40 graus Celsius com um tempo de aquecimento de 300 minutos durante a noite.