Coloração de DNA extracelular: um método para identificar DNA extracelular em seções de tecido FFPE

Uma célula moribunda libera uma fração de DNA fora da célula chamada DNA extracelular. Para corar o DNA extracelular, comece fazendo uma seção de tecido embebida em parafina, ou FFPE, fixada em formalina em uma lâmina de vidro. Aqueça a lâmina de vidro pela duração desejada. Isso facilita a fixação do tecido na superfície da lâmina e amolece a parafina circundante.

Mergulhe a lâmina no líquido de desparafinização para dissolver completamente a camada de parafina ao redor do tecido. Em seguida, mergulhe a lâmina em concentrações decrescentes de etanol para reidratar o tecido desparafinizado. Após a reidratação, mergulhe a lâmina em solução de recuperação de antígeno em ebulição. Este tratamento desmascara os epítopos que foram alterados durante o processo de fixação.

Cubra a lâmina com anticorpos primários e permita que eles se liguem a epítopos específicos não mascarados presentes na célula. Em seguida, adicione anticorpos secundários marcados com fluorescência, que se ligam aos anticorpos primários. Mergulhe a lâmina na solução Sudan Black para reduzir a autofluorescência de fundo.

Por fim, coloque uma gota de meio de montagem suplementado com DAPI sobre a seção de tecido e sele-a com uma lamínula. Incubar para permitir que as moléculas de DAPI corem o DNA. Visualize a seção de tecido preparada usando um microscópio de fluorescência. Os epítopos marcados com fluorescência na célula ajudam a diferenciar o DNA nuclear presente dentro da célula do DNA extracelular.

Para coloração de DNA extracelular, primeiro, aqueça as amostras de interesse no rack de lâminas a 60 graus Celsius por 60 minutos antes de mergulhar as lâminas em duas trocas de solvente de 40 minutos em uma capela de exaustão. Após a segunda imersão, reidratar as amostras duas vezes em etanol 100% e uma vez em etanol 70% por 5 minutos por tratamento.

Após o último tratamento, use pinças para colocar as lâminas na solução de recuperação de antígeno fervente em uma panela de pressão alta por 10 minutos. Depois de desmascarar os epítopos do antígeno, transfira a panela de pressão do calor para uma pia e imediatamente deixe correr água fria da torneira sobre a tampa.

Deixar as lâminas equilibrarem-se durante 20 minutos na solução de recuperação de antigénios antes de lavar as amostras duas vezes em PBS 0,01 molar num agitador orbital durante 5 minutos por lavagem. Após a segunda lavagem, use uma caneta hidrofóbica para desenhar círculos ao redor das amostras de tecido renal e bloquear qualquer coloração inespecífica com 60 microlitros de soro de frango a 10% em albumina de soro bovino a 5% por 30 minutos em temperatura ambiente.

No final da incubação, substitua cuidadosamente a solução de bloqueio por 60 microlitros do anticorpo primário de interesse em uma câmara de umidade durante a noite a 4 graus Celsius. Na manhã seguinte, lave as lâminas em um agitador orbital em PBS por 2 minutos por lavagem antes de adicionar 60 microlitros de um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado a cada lâmina para uma incubação de 40 minutos em temperatura ambiente.

No final da incubação, lave as lâminas em PBS conforme demonstrado, seguido de tratamento em 0,3% de Sudan Black em etanol 70% para extinguir qualquer potencial autofluorescência induzida por formalina. Após 30 minutos, lave as lâminas em água da torneira para remover qualquer precipitado e mergulhe as lâminas em PBS por 10 minutos para evitar a formação de mais precipitado Sudan Black.

No final da incubação, monte as lâminas em lamínulas de vidro confocais com gotas de 360 microlitros de solução de montagem complementada com DAPI e sele as lamínulas com esmalte. Deixe as lâminas curarem por 24 horas em temperatura ambiente. Armazene-os a 4 graus Celsius protegidos da luz até a imagem por microscopia confocal de varredura a laser de acordo com protocolos padrão.