Derivação de podócitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas: um procedimento para diferenciação direcionada de podócitos renais maduros de células-tronco

As células maduras podem ser reprogramadas para recuperar seu estado indiferenciado e proliferativo semelhante a células-tronco. Essas células reprogramadas são chamadas de células-tronco pluripotentes induzidas ou IPSCs. Para diferenciar células pluripotentes em células especializadas em podócitos envolvidas na filtração de resíduos dos rins, comece tomando uma suspensão de IPSCs humanas em um meio de indução de mesoderma.

Transfira esta suspensão para uma placa de cultura revestida com matriz basal e incuba. A matriz de embasamento facilita a adesão de IPSCs na base. Posteriormente, os fatores específicos presentes no meio induzem a diferenciação das IPSCs nas células do mesoderma, as células precursoras dos podócitos. Aspire a mídia gasta.

Completar a placa com o volume desejado de um meio de indução intermédio do mesoderma e incubar durante um período prolongado. Esta etapa leva à diferenciação das células mesodérmicas em podócitos imaturos. Substitua o meio intermediário de indução do mesoderma por uma solução de tripsina para dissociar as células aderentes da placa.

Em seguida, centrifugue para peletizar as células. Rejeitar o sobrenadante que contém a solução de tripsina e os fragmentos da matriz. Ressuspenda o pellet em um meio de indução de podócitos. Transferir a suspensão celular para uma nova placa de cultura revestida. Incubar para permitir o desenvolvimento de várias projeções semelhantes a pés a partir de células intermediárias, resultando na formação de podócitos maduros.

Após a contagem, ressuspenda as células a uma concentração de 1 vezes 10 elevado à quinta células por mililitro de meio de indução do mesoderma e aspire a solução de matriz extracelular das placas revestidas com 2 da matriz da membrana basal. Enxágue as placas duas vezes com meio quente e misture a suspensão de células-tronco pluripotentes induzida pelo homem com pipetagem suave.

Adicione 1 mililitro de células a cada poço da matriz da membrana basal 2 placas de 12 poços revestidas e agite suavemente as placas para distribuir as células de maneira mais uniforme. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células. Nos dias 2 a 15 da diferenciação, substitua o meio de indução do mesoderma por 1 mililitro de meio de indução intermediário do mesoderma por alvéolo.

Se for observado um crescimento celular substancial e uma rápida depleção de nutrientes, conforme indicado pelo amarelecimento do meio, o volume do meio intermediário de diferenciação do mesoderma pode ser aumentado para 1,3 mililitros por poço. No dia 16 de cultura, enxágue as células intermediárias do mesoderma com meio quente e incube as células com 500 microlitros de tripsina-EDTA a 0,05% por poço por 3 minutos a 37 graus Celsius.

Quando as células começarem a se dissociar, raspe as células com um levantador de células e misture suavemente as células pipetando. Pare a reação com cerca de 2 mililitros de solução neutralizante de tripsina por poço e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros. Aumente o volume para 50 mililitros com meio e colete as células por centrifugação.

Ressuspenda o meio de indução de pellets e podócitos em 1 vezes 10 elevado a quintas células por mililitro de concentração média e adicione as células às placas revestidas com 2 matrizes da membrana basal. Em seguida, agite suavemente a placa para ajudar a distribuir as células de maneira mais uniforme e coloque-as na incubadora por até 5 dias.

• Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) - Reprogrammed mature cells with a proliferative, undifferentiated state similar to stem cells.
• Podocytes - Specialized cells involved in the filtration of waste from kidneys.
• Mesoderm Cells - Precursor cells for podocytes that are derived from IPSCs.
• Mature Podocytes - Fully developed podocytes, characterized by several foot-like projections.
• Directed Differentiation - A process of driving the development of undifferentiated cells into a specific cell type.

• Introduce Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) - Cells which can be reprogrammed to regain a stem cell-like state (e.g., pluripotent).
• Key Concepts - Summarization of the steps from IPSCs to mature podocytes (e.g., directed differentiation of IPSCs, kidney mesoderm).
• Underlying Mechanisms - This involves various elements, such as media induction, cell incubation, and resuspension (e.g., deriving).
• Connect to Experiment - Understanding of how this process is valuable in studying kidney functions (e.g., podocytes kidney, normal human kidney podocytes).

• What are Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) and how are they reprogrammed?
• What are podocytes and how do they function in the kidney?
• What is the process of deriving podocytes from mesoderm cells?

• Practical Applications - Generation of podocytes could be used in testing pharmaceutical effects on kidneys (e.g., kidney podocytes).
• Industry Impact - The research may offer new treatments for kidney-related diseases (e.g., human podocytes).
• Societal Importance - A better understanding of the IPSCs may revolutionize regenerative medicine (e.g., pluripotent).
• Link to Scientific Advancements - The evolution of technology that could manipulate cell development (e.g., directed differentiation of ipsc).