Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:45 min. • April 30th, 2023
As células do músculo liso detrusor, ou DSM, presentes na parede da bexiga urinária constituem a unidade funcional primária da bexiga. Essas células relaxam para facilitar o armazenamento de urina na bexiga e se contraem para liberar a urina.
Para isolar as células do DSM, comece coletando uma amostra colhida da bexiga urinária humana. Lave a amostra para remover quaisquer vestígios de sangue e detritos. Em seguida, prenda o tecido com a superfície mucosa voltada para cima. Extirpar a gordura, os vasos sanguíneos e a camada mucosa para expor a camada muscular detrusora subjacente. Em seguida, corte o tecido livre de mucosa em pequenos fragmentos.
Trate os fragmentos de tecido com um coquetel de digestão contendo papaína e incuba. A papaína, uma enzima proteolítica, promove a digestão de proteínas na matriz extracelular que mantêm as células unidas e inicia o afrouxamento das células na matriz. Agora, remova o sobrenadante contendo papaína.
Adicione a suspensão da enzima colagenase aos fragmentos de tecido e incube à temperatura fisiológica. A colagenase quebra a matriz extracelular e facilita a dissociação das células DSM. A incubação à temperatura fisiológica ajuda a preservar a integridade celular do DSM. Descarte o sobrenadante contendo colagenase.
Lave os fragmentos de tecido com um tampão gelado para remover quaisquer enzimas residuais. Em seguida, suspenda-os novamente no buffer. Triture suavemente os fragmentos de tecido tratados com enzimas para garantir a dissociação completa de quaisquer células não liberadas e obter uma suspensão unicelular de células DSM. Armazene as células DSM em baixas temperaturas até uso posterior.
Comece examinando toda a amostra da bexiga urinária. Prenda a amostra, com a mucosa voltada para cima e a serosa para baixo, em um prato redondo de 150 milímetros revestido com enantiômero de silicone preenchido com DS gelado e remova cuidadosamente toda a mucosa por dissecção aguda.
Corte vários pedaços de músculo liso detrusor sem mucosa ou DSM. Coloque 3 a 6 pedaços de DSM em um tubo com 1 a 2 mililitros de DS pré-aquecido contendo papaína e ditiotreitol ou DS-P. Incube-os a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos, certificando-se de agitar o tubo a cada 10 a 15 minutos.
Após a incubação, remova o DS-P do tubo e lave brevemente as peças do DSM com DS gelado. Transfira o DS com peças do DSM para um novo tubo e remova o DS, deixando as peças do DSM no fundo do tubo. Adicione 1 a 2 mililitros de DS contendo colagenase tipo II ou DS-C ao tubo e incube a 37 graus Celsius com agitação ocasional.
Descarte o DS-C e lave os pedaços de DSM tratados com enzimas de 5 a 10 vezes com DS gelado. Após a última lavagem, deixe o DS dentro do tubo e triture suavemente as peças com uma pipeta Pasteur polida a fogo para liberar células DSM individuais.