JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 2:42 min • April 30th, 2023
Os esferoides cancerígenos são agregados celulares tridimensionais de células tumorais. Esses esferoides podem ser incorporados na matriz de colágeno, resultando na formação de blocos esferoides. Para congelar rapidamente um bloco esferoide, comece colocando um bloco esferóide de gel de colágeno no centro de um molde histológico.
Enxágue o bloco com um tampão adequado e complemente o molde com uma solução fixadora. Incube para permitir que esta solução penetre nos esferóides e reticule as proteínas celulares. Esta etapa ajuda a manter a estrutura esferóide para o procedimento subsequente. Em seguida, aspire a solução fixadora.
Coloque o bloco de gel esferóide em um molde de histologia fresco contendo uma fina camada de meio de incorporação. Sobreponha-o com mais meio de incorporação para submergir completamente o bloco esferoide. Por fim, mergulhe o molde em um banho de nitrogênio líquido por um curto período.
O congelamento rápido evita a formação de cristais de gelo maiores dentro dos esferóides. Ajuda a manter a integridade do esferóide sem causar danos mecânicos. Assim que a camada intermediária de incorporação solidificar ao redor do bloco esferoide, remova o bloco congelado do molde. Armazene o bloco esferóide congelado em baixas temperaturas para posterior análise histológica.
Primeiro, use uma pequena pinça para levantar o bloco de gel de colágeno e esferóides da lâmina da câmara. Em seguida, coloque o bloco de gel de colágeno em um molde de histologia de plástico. Enxágue o bloco de gel de colágeno com 1X PBS brevemente e fixe-o com 4% de PFA em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, lave o bloco de gel de colágeno com 1,5 mililitros de 1X PBS em uma coqueteleira por 15 minutos.
Aplique uma fina camada de composto OCT no fundo de um novo molde de histologia de plástico. Em seguida, coloque o bloco de gel de colágeno fixo e lavado em cima do composto OCT antes de preencher cuidadosamente o restante do molde com o composto OCT. Mantenha o molde a 4 graus Celsius por 1 hora. Depois disso, congele rapidamente o molde em uma placa de Petri de 100 milímetros flutuando em nitrogênio líquido e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius.