Entrega de plasmídeos de DNA no urotélio da bexiga de camundongo: um procedimento baseado em eletroporação para entregar plasmídeos de DNA de forma eficiente em células uroteliais da bexiga murina para gerar modelos geneticamente modificados

Para começar, prepare um camundongo fêmea anestesiado na posição supina. Certifique-se de que a bexiga esteja completamente vazia. Através da abertura uretral, insira um cateter lubrificado. A lubrificação auxilia na passagem uretral suave para a entrada na bexiga.

Após o cateterismo, faça uma incisão abdominal e disseque a musculatura interna para expor a bexiga. Em seguida, pipete uma suspensão de plasmídeos de DNA misturada com um corante adequado na extremidade externa do cateter. Esses plasmídeos de DNA codificam um gene repórter fluorescente.

Conecte uma seringa ao cateter e empurre-a para entregar a solução plasmidial na bexiga. As moléculas de corante injetadas colorem a bexiga, confirmando a administração bem-sucedida da solução de plasmídeo. Remova o conjunto do cateter e aperte o orifício uretral externo para evitar que a solução plasmidial saia.

Agora, aperte a bexiga usando dois eletrodos conectados a um gerador de eletroporação. Aplique pulsos elétricos de voltagem apropriada por um período desejado na bexiga. A exposição do urotélio da bexiga, o revestimento mais interno da bexiga, aos campos elétricos aplicados resulta em poros temporários na membrana celular urotelial.

O aumento da permeabilidade da membrana permite a entrega eficiente dos plasmídeos de DNA injetados nas células. Após a eletroporação, suturar a incisão cirúrgica. Permita que o mouse se recupere. As células uroteliais transfectadas com os plasmídeos de DNA expressam proteínas repórteres fluorescentes.

Para cada bexiga a ser transfecto, prepare pelo menos 20 microlitros de plasmídeo de DNA a 1 micrograma por microlitro. Em seguida, adicione 1 microlitro de Trypan Blue aos 20 microlitros de solução de plasmídeo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e pipete para misturar bem. Para entregar o plasmídeo, aplique etanol a 70% no abdômen. Faça uma incisão vertical de 1 centímetro para abrir a pele abdominal acima da bexiga.

Em seguida, corte a camada muscular para expor a bexiga. Pipete pelo menos 20 microlitros de plasmídeo mais solução de azul de tripano na extremidade externa do cateter e conecte-o à seringa. Em seguida, injete a solução de plasmídeo na bexiga. Se a bexiga ficar azul, a injeção é bem-sucedida. Deixe um pouco de líquido no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.

Em seguida, pegue o orifício uretral externo e remova o cateter e a seringa. Use um barbante para apertar o orifício uretral externo. Faça dois laços com o barbante e depois amarre com dois nós. Este é um passo crucial que requer a cooperação de duas pessoas. Certifique-se de que os nós estejam apertados para que os plasmídeos não vazem.

Agora, ligue o gerador de eletroporação. Aperte a bexiga com dois eletrodos e pressione o pedal para realizar a eletroporação. Para manter a bexiga apoiada, pode-se beliscar a parte de trás da incisão abdominal com uma pinça. Evite qualquer contato entre a pinça e os eletrodos, pois isso pode gerar uma faísca.

Quando estiver pronto, suturar a abertura abdominal e cutânea com sutura cirúrgica estéril. Remova a corda e aplique clipes. Aplique iodo na ferida e, em seguida, remova o animal do sistema isoflurano. Administre analgésico de buprenorfina por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica. Mantenha o animal na almofada de aquecimento e devolva-o à gaiola de casa após a recuperação total.

• Catheter - A tube device used for delivery or removal of fluids to/from body areas.
• Plasmid - A small, circular, double-stranded DNA molecule, typically coding for a specific function.
• Urothelium - Innermost lining of the bladder, it forms a barrier against toxins in urine.
• Electroporation - Technique using electrical field for increased permeability of cell membranes.
• Suture - A stitch or row of stitches holding together the edges of a wound or surgical incision.

• Introducing catheter - A tool for internal medical procedures, lubricated for smooth insertion.
• Defining plasmid - Small segments of DNA with the potential to encode valuable proteins.
• Detailing electroporation - A technique allowing temporary pore formation in cell membranes for increased permeability.
• Connecting to Experiment - The process of transfecting urothelial cells with fluorescent protein-encoding DNA

• What is a catheter and how does its lubrication aid in bladder catheterization?
• What are DNA plasmids and how do they associate with fluorescent reporter proteins?
• How does electroporation assist in effective plasmid delivery into urothelium cells?

• Practical Application - Catheterization, electroporation in gene therapy and clinical treatments.
• Industry Impact - Medical equipment manufacturing and healthcare industries.
• Societal Importance - Facilitates understanding and treatment of bladder diseases.
• Link to advancements - Electroporation as an effective method for gene transfer.