Isolamento de exossomos: uma técnica de ultracentrifugação baseada em densidade usando almofada de sacarose para separar exossomos de meios condicionados de células cultivadas

Os exossomos - vesículas de tamanho nanométrico ligadas à membrana que carregam biomoléculas funcionais - são ativamente secretados pela maioria dos tipos de células e podem ser isolados de sobrenadantes de cultura de células in vitro. Para isolar exossomos, primeiro colha o sobrenadante ou meio condicionado de uma cultura de células de interesse. O meio condicionado conteria exossomos, proteínas, detritos celulares e vesículas.

Centrifugue o meio para pellet os detritos celulares. Colete o sobrenadante contendo exossomos e filtre-o através de filtros celulares para remover as vesículas maiores. Transfira um volume específico do meio filtrado para um novo tubo. Em seguida, misture concentrações apropriadas de sacarose e óxido de deutério para preparar uma almofada de sacarose - um gradiente descontínuo de sacarose.

Adicionar um volume específico da solução de almofada de sacarose ao tubo que contém o meio; a solução forma uma camada separada na parte inferior. Agora, centrifugue o tubo em alta velocidade. A almofada de sacarose facilita a migração de exossomos do meio para a solução de sacarose, mantendo a integridade do exossomo. Os contaminantes proteicos de alta densidade ocupam a interface entre a solução de sacarose e o meio.

Transferir cuidadosamente a maior parte da camada de sacarose contendo exossomas para um novo tubo com um tampão adequado. Centrifugar a alta velocidade para obter um pellet de exossomas purificados. Descarte o sobrenadante contendo sacarose junto com quaisquer contaminantes proteicos. Ressuspenda o pellet de exossomo em tampão e armazene em baixas temperaturas até uso posterior.

Para pré-limpar o meio condicionado coletado, centrifugue-o a 500 x g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e rejeitar o sedimento. Depois de repetir esta etapa de centrifugação com o sobrenadante recuperado, recuperar novamente o sobrenadante e rejeitar o sedimento.

Em seguida, centrifugue o sobrenadante recuperado a 2.000 x g por 15 minutos e 4 graus Celsius. Guarde o sobrenadante e descarte o pellet. Filtre o sobrenadante uma vez através de um filtro de 0,22 micrômetro conectado a uma seringa de 20 mililitros em um novo tubo de centrífuga.

Enquanto isso, para preparar a solução de sacarose a 25% em óxido de deutério, pese com precisão 1,9 gramas de sacarose em um tubo universal. Em seguida, adicione óxido de deutério até que o peso atinja 7,6 gramas. Em seguida, encha um tubo de ultracentrífuga com 22,5 mililitros de meio condicionado pré-limpo.

Coloque uma pipeta de vidro no tubo. Adicione 3 mililitros de solução de sacarose através da pipeta para que a solução forme uma camada separada abaixo do meio condicionado. Coloque cuidadosamente o tubo contendo a solução de sacarose média condicionada em camadas no balde de um rotor basculante.

Prenda o balde no rotor. Coloque o rotor na ultracentrífuga e gire-o 100.000 x g a 4 graus Celsius por 1,5 horas. Colete 2 mililitros da camada de sacarose do tubo, 1 mililitro de cada vez, usando uma pipeta P1000 com a ponta presa a uma ponta de 10 microlitros e adicione-a a um frasco de ultracentrífuga contendo 20 mililitros de PBS filtrado para lavagem.

Coloque o tubo em um rotor de ângulo fixo e centrifugue-o a 100.000 x g a 4 graus Celsius por 1,5 horas. Use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para remover cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet com 400 microlitros de PBS filtrado.