Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:04 min. • April 30th, 2023
Os exossomos - vesículas de membrana derivadas de células de tamanho nanométrico - exibem potencial como veículos de entrega terapêutica para RNA ou siRNA interferente de fita dupla pequena.
Após a liberação no citoplasma da célula-alvo, o siRNA se liga ao complexo silenciador induzido por RNA. O complexo ativado então reconhece e se liga a um mRNA específico, regulando negativamente sua expressão e mediando o silenciamento gênico.
Para encapsular o siRNA em exossomos, primeiro, resfrie uma cubeta de eletroporação no gelo. Em seguida, misture exossomos e siRNA específico em um tubo na proporção desejada usando um tampão de eletroporação adequado. Agora, transfira essa mistura para a cubeta pré-resfriada.
Feche a cubeta e coloque-a no suporte da cubeta do eletroporador. Gire a roda giratória para garantir que a cubeta entre em contato com os eletrodos de eletroporação. Agora, execute o programa de eletroporação selecionado.
Durante a eletroporação, os pulsos elétricos perturbam a bicamada fosfolipídica dos exossomos suspensos no tampão condutor. Isso resulta na formação de poros transitórios na membrana do exossomo, promovendo a difusão de siRNA na vesícula. O tampão ajuda a prevenir a agregação de siRNA.
Uma vez concluída a eletroporação, os poros selam novamente, prendendo o siRNA dentro. Por fim, retire a cubeta do eletroporador e transfira a mistura para um novo tubo. Armazene os exossomos encapsulados em siRNA em baixas temperaturas até uso posterior.
Antes de iniciar a eletroporação, pré-resfrie a cubeta de eletroporação no gelo por 30 minutos. Misture 7 microgramas de exossomos com 0,33 microgramas de siRNA no tubo de microcentrífuga. Adicione um tampão de ácido cítrico para atingir o volume de 150 microlitros. Adicione a mistura de exossomo-siRNA à cubeta de eletroporação usando uma pipeta de plástico e tampe a cubeta.
Coloque a cubeta na orientação correta no suporte da cubeta do eletroporador e gire a roda giratória do eletroporador 180 graus no sentido horário. Selecione o programa desejado e pressione o botão Iniciar para iniciar a eletroporação. O display indicará um pulso bem-sucedido.
Em seguida, gire a roda 180 graus no sentido anti-horário e remova a cubeta. Use uma pipeta de plástico para remover a amostra da cubeta para um novo tubo de microcentrífuga. Mantenha o tubo no gelo ou na geladeira antes de processá-lo novamente, se não for usado imediatamente.