Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:21 min. • April 30th, 2023
Para isolar células epiteliais tubulares renais ou TECs, comece pegando um rim de camundongo recém-isolado em uma placa de Petri. Retire a cápsula renal - a fina camada externa que envolve o rim - e remova a medula ou a parte mais interna do rim, deixando o córtex contendo o túbulo e as células epiteliais tubulares.
Pique as partes renais restantes em pedaços pequenos e incuba-as em um tampão de digestão quente contendo a enzima colagenase. A colagenase quebra a proteína de colágeno que mantém os tecidos renais juntos, liberando os túbulos renais e as células renais em suspensão.
Filtrar a suspensão para remover os tecidos renais não digeridos. Em seguida, adicione meios de cultura pré-resfriados ao filtrado. A temperatura mais baixa neutraliza a colagenase e interrompe a digestão dos tecidos. Centrifugue o filtrado em baixa velocidade para permitir que os túbulos mais densos e as células tubulares se assentem enquanto outros tipos de células e impurezas permanecem suspensos.
Remova essa fração sobrenadante indesejada e adicione meios de cultura para ressuspender o pellet. Semeie a suspensão em uma placa de cultura revestida de colágeno e incuba. As células tubulares livres se ligam firmemente ao colágeno enquanto os túbulos permanecem suspensos. Subcultura para remover os túbulos soltos e obter a cultura primária de células epiteliais tubulares.
Para processar os rins colhidos, primeiro remova as cápsulas renais e a medula. Em seguida, pique os dois rins em pedaços minúsculos e incuba-os em 10 mililitros de tampão de digestão em um forno a 37 graus Celsius com rotação suave por 5 minutos.
Após a digestão, remova todos os tecidos não digeridos passando o tampão por um filtro de 70 mícrons. Depois de coletar o tecido digerido, adicione 10 mililitros de meio de cultura para interromper a digestão. Em seguida, centrifugue a suspensão de tecido filtrado a 50 x g por 5 minutos para pellet as células tubulares. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo, adicione 5 mililitros de meio de cultura e repita a centrifugação para coletar as células tubulares restantes.
Agora, ressuspenda o primeiro pellet em 20 mililitros de meio de cultura e centrifugue-o a 50 x g por 5 minutos para purificar ainda mais as células coletadas. Descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda os dois pellets em 10 mililitros de meio de cultura. Em seguida, conte as células vivas usando a coloração Trypan Blue. Em seguida, semeie até 10 milhões de células em um prato revestido de colágeno de 60 milímetros e deixe as células tubulares se ligarem durante a noite.