Isolamento de células renais murinas: uma técnica para isolar e gerar cultura primária de células epiteliais tubulares renais

0 vistas3:21 min • April 30th, 2023

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Para isolar células epiteliais tubulares renais ou TECs, comece pegando um rim de camundongo recém-isolado em uma placa de Petri. Retire a cápsula renal - a fina camada externa que envolve o rim - e remova a medula ou a parte mais interna do rim, deixando o córtex contendo o túbulo e as células epiteliais tubulares.

Pique as partes renais restantes em pedaços pequenos e incuba-as em um tampão de digestão quente contendo a enzima colagenase. A colagenase quebra a proteína de colágeno que mantém os tecidos renais juntos, liberando os túbulos renais e as células renais em suspensão.

Filtrar a suspensão para remover os tecidos renais não digeridos. Em seguida, adicione meios de cultura pré-resfriados ao filtrado. A temperatura mais baixa neutraliza a colagenase e interrompe a digestão dos tecidos. Centrifugue o filtrado em baixa velocidade para permitir que os túbulos mais densos e as células tubulares se assentem enquanto outros tipos de células e impurezas permanecem suspensos.

Remova essa fração sobrenadante indesejada e adicione meios de cultura para ressuspender o pellet. Semeie a suspensão em uma placa de cultura revestida de colágeno e incuba. As células tubulares livres se ligam firmemente ao colágeno enquanto os túbulos permanecem suspensos. Subcultura para remover os túbulos soltos e obter a cultura primária de células epiteliais tubulares.

Para processar os rins colhidos, primeiro remova as cápsulas renais e a medula. Em seguida, pique os dois rins em pedaços minúsculos e incuba-os em 10 mililitros de tampão de digestão em um forno a 37 graus Celsius com rotação suave por 5 minutos.

Após a digestão, remova todos os tecidos não digeridos passando o tampão por um filtro de 70 mícrons. Depois de coletar o tecido digerido, adicione 10 mililitros de meio de cultura para interromper a digestão. Em seguida, centrifugue a suspensão de tecido filtrado a 50 x g por 5 minutos para pellet as células tubulares. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo, adicione 5 mililitros de meio de cultura e repita a centrifugação para coletar as células tubulares restantes.

Agora, ressuspenda o primeiro pellet em 20 mililitros de meio de cultura e centrifugue-o a 50 x g por 5 minutos para purificar ainda mais as células coletadas. Descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda os dois pellets em 10 mililitros de meio de cultura. Em seguida, conte as células vivas usando a coloração Trypan Blue. Em seguida, semeie até 10 milhões de células em um prato revestido de colágeno de 60 milímetros e deixe as células tubulares se ligarem durante a noite.

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Última atualização: 1 agosto 2026