Injeção hidrodinâmica da pelve renal: uma técnica para entregar DNA diretamente em células renais de modelo murino

Para entregar o DNA do plasmídeo diretamente nas células renais do camundongo, comece colocando um camundongo anestesiado em uma posição lateral. Prepare o mouse removendo o pelo dorsal do lado. Localize um local de incisão apropriado no flanco esquerdo, abaixo da caixa torácica.

Faça um pequeno corte na pele e nas camadas musculares subjacentes. Em seguida, aplique uma leve pressão na cavidade abdominal para expor o rim através do local da incisão. Remova parcialmente o tecido adiposo perineférgico sobreposto para visualizar a pelve renal.

Agora, pegue uma seringa contendo DNA de plasmídeo em um tampão de entrega hidrodinâmico. Insira a agulha diretamente na pelve renal - uma porção triangular e dilatada do ureter no rim. Injete a solução plasmidial rapidamente, de modo que o DNA atinja diretamente o parênquima renal - a parte funcional do rim que filtra o sangue.

A entrega rápida de grande volume de fluido através da pelve renal cria uma alta pressão, criando poros transitórios na membrana plasmática das células parenquimatosas renais. Isso facilita a entrada de plasmídeos nas células. Eventualmente, esses poros se fecham, prendendo os plasmídeos dentro das células.

Por fim, retraia a agulha e retorne o rim à cavidade abdominal. Suturar as camadas de pele e músculo no local da incisão.

Use luvas cirúrgicas estéreis e, começando pelo lado da incisão, limpe o animal com um novo cotonete de clorexidina/álcool três vezes em movimentos circulares. Agora, localize o local da incisão. Aperte a pele com uma pinça e, usando uma tesoura, corte a camada de pele a aproximadamente 1 centímetro da coluna abaixo da caixa torácica. Faça outro corte central abaixo na camada muscular. Localize o rim e, sem tocá-lo, exponha-o suavemente da cavidade abdominal, aplicando uma pressão suave e constante no abdômen com os dedos.

Expor o rim às vezes é difícil. Aplique uma leve pressão no abdômen e na coluna para evitar danificar o baço. Se outros órgãos além do rim saírem, devolva-os suavemente à cavidade do corpo usando uma pinça fechada, se necessário.

Em seguida, separe suavemente o rim da gordura circundante apenas o suficiente para visualizar a pelve renal, que pode ser vista como um pequeno ponto branco. Depois de visualizar a pelve renal, use uma pinça fechada para empurrar para baixo o lado direito do rim, de modo que a pelve renal permaneça à vista. Em seguida, segure a seringa de insulina carregada com a mão direita, segurando-a paralelamente à superfície de trabalho e insira a agulha cuidadosamente na pelve renal.

Assim que a agulha estiver inserida, injete a solução rapidamente em 3 segundos. Deixe a agulha permanecer no lugar por aproximadamente 10 segundos para evitar o refluxo da solução. Em seguida, remova a agulha lenta e cuidadosamente e retorne o órgão à cavidade abdominal esticando suavemente o local da incisão usando uma pinça fechada. Agora, suture a camada muscular com suturas absorvíveis 5-0 e coloque 2 a 4 nós independentes. Da mesma forma, suturar a camada de pele com suturas de náilon não absorvíveis 5-0 ou 6-0 e colocar 2 a 4 nós independentes.