Análise de Expressão de Proteínas Baseada em Matrizes de Proteínas de Fase Reversa: Um Procedimento para Quantificação Simultânea da Expressão de Múltiplas Proteínas do Lisado Celular

Uma amostra de tumor contém uma população heterogênea de proteínas. Usando lisado tumoral, várias dessas proteínas podem ser analisadas paralelamente para identificar a proteína de interesse. Essa técnica de alto rendimento é chamada de Reverse Phase Protein Arrays ou RPPA.

Para realizar o RPPA, comece pegando uma lâmina de vidro de imunoensaio revestida com nitrocelulose. Identifique uma série de proteínas lisadas de tumor na lâmina. Incubar para permitir a captura de proteínas na nitrocelulose. Em seguida, trate a lâmina com um tampão de bloqueio que bloqueia locais de ligação de anticorpos não específicos nas proteínas.

Remova o excesso de solução de bloqueio. Agora, monte a lâmina revestida de proteína em um suporte e feche-a bem. Isso cria poços temporários sobre a superfície do slide. Em seguida, carregue os poços com uma solução de anticorpos primários. Esses anticorpos reconhecem epítopos presentes no alvo correspondente a partir de uma mistura de proteínas na matriz.

Finalmente, adicione anticorpos secundários marcados com fluorescência. Esses anticorpos se ligam aos anticorpos primários pré-ligados, formando um complexo. Lave a lâmina para remover quaisquer anticorpos secundários não ligados. Desaperte a corrediça do suporte e deixe-a secar ao ar.

Digitalize a lâmina usando um scanner fluorescente. As proteínas-alvo marcadas com anticorpos fluorescem em um comprimento de onda específico e aparecem como manchas coloridas na superfície da lâmina.

Antes da impressão RPPA, uma série de cinco diluições duplas é feita a partir de cada amostra. Um dos aspectos mais demorados desse procedimento é fazer centenas de diluições. O resultado bem-sucedido pode ser garantido verificando novamente antes de imprimir as lâminas.

Um observador robótico MicroGrid II é então usado para detectar lisados de proteínas em lâminas de vidro revestidas de nitrocelulose. Cada amostra é manchada em triplicata, resultando em um total de 15 pontos por amostra. As lâminas usadas neste experimento contêm duas almofadas nas quais as amostras são localizadas. Cada almofada foi manchada com amostras idênticas, neste caso, 100 amostras. Outros formatos disponíveis incluem slides de 1, 8 e 16 almofadas. Quanto maior o número de almofadas, menor o número de amostras que podem ser vistas em cada uma.

Para iniciar o procedimento de detecção de proteínas, molhe as lâminas em excesso de tampão de bloqueio e incube em temperatura ambiente por 1 hora em uma plataforma de balanço. Prepare 800 microlitros de anticorpos primários em tampão de bloqueio nas concentrações desejadas e mantenha no gelo. Após a incubação de uma hora no buffer de bloqueio, monte as lâminas no Chip Clip de quadro único ou no suporte de lâmina de quatro baias FastFrame para que uma vedação firme seja formada entre a lâmina e a câmara de incubação.

Remova o tampão residual dos poços e adicione 600 microlitros de anticorpo primário aos respectivos poços. Coloque as lâminas e a câmara em uma caixa úmida selada e incube em uma plataforma de balanço durante a noite a 4 graus Celsius. Na manhã seguinte, remova as lâminas da câmara fria. Remova cuidadosamente os anticorpos primários de cada poço. Adicione 600 microlitros de 0,1% de PBS-Tween20 ou PBS-T e lave as lâminas em uma plataforma de balanço em temperatura ambiente por 5 minutos.

Substitua o PBS-T por PBS-T novo. Desta forma, lave as lâminas um total de três vezes. Remova o tampão dos poços e adicione 600 microlitros de anticorpos secundários marcados com fluorescência na diluição apropriada aos respectivos poços. Incubar com anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 45 minutos com agitação suave. É importante proteger a membrana da luz até o momento em que ela é digitalizada. Após 45 minutos, remova os anticorpos secundários dos poços e lave brevemente três vezes em 600 microlitros de PBS-T à temperatura ambiente.

Remova as lâminas do transportador, transfira para um recipiente adequado e lave o excesso de PBS-T por 15 minutos, mantendo a membrana no escuro. Remova o PBS-T e lave a membrana com PBS em temperatura ambiente por 15 minutos para remover o Tween20 residual, novamente mantendo a membrana no escuro. Seque os Fastslides em forno a 50 graus Celsius por 10 minutos. Por fim, escaneie as lâminas em 680 nanômetros e / ou 800 nanômetros, dependendo dos anticorpos secundários usados.