Análise de Expressão de Proteínas Baseada em Matrizes de Proteínas de Fase Reversa: Um Procedimento para Quantificação Simultânea da Expressão de Múltiplas Proteínas do Lisado Celular

Uma amostra de tumor contém uma população heterogênea de proteínas. Usando lisado tumoral, várias dessas proteínas podem ser analisadas paralelamente para identificar a proteína de interesse. Essa técnica de alto rendimento é chamada de Reverse Phase Protein Arrays ou RPPA.

Para realizar o RPPA, comece pegando uma lâmina de vidro de imunoensaio revestida com nitrocelulose. Identifique uma série de proteínas lisadas de tumor na lâmina. Incubar para permitir a captura de proteínas na nitrocelulose. Em seguida, trate a lâmina com um tampão de bloqueio que bloqueia locais de ligação de anticorpos não específicos nas proteínas.

Remova o excesso de solução de bloqueio. Agora, monte a lâmina revestida de proteína em um suporte e feche-a bem. Isso cria poços temporários sobre a superfície do slide. Em seguida, carregue os poços com uma solução de anticorpos primários. Esses anticorpos reconhecem epítopos presentes no alvo correspondente a partir de uma mistura de proteínas na matriz.

Finalmente, adicione anticorpos secundários marcados com fluorescência. Esses anticorpos se ligam aos anticorpos primários pré-ligados, formando um complexo. Lave a lâmina para remover quaisquer anticorpos sec