Microinjeção intravenosa de nefrotoxinas em embrião de peixe-zebra: uma técnica para administrar agentes nefrotóxicos na corrente sanguínea de embriões de peixe-zebra

A microinjeção intravenosa facilita a entrega de moléculas de interesse na corrente sanguínea de um animal receptor. Para entregar nefrotoxinas em um embrião de peixe-zebra, primeiro prepare uma concentração apropriada da solução de nefrotoxina desejada.

Usando uma ponta de carregamento de gel fino, carregue esta solução de nefrotoxina em uma agulha de microinjeção com uma ponta angular afiada. Suspenda a agulha verticalmente para permitir que a solução de nefrotoxina preencha a ponta da agulha por gravidade. Agora, prenda a agulha de microinjeção carregada no suporte de um micromanipulador.

Posteriormente, transfira um embrião de peixe-zebra anestesiado para o molde de microinjeção pré-fabricado. Alinhe o embrião no molde com a cabeça orientada para dentro do poço e a cauda para fora do poço, melhorando a acessibilidade à cauda para microinjeção. Em seguida, posicione com precisão a ponta da agulha perto do embrião.

Injete a solução de nefrotoxina na veia da cauda do embrião. Os agentes nefrotóxicos injetados se espalham pela circulação e atingem órgãos distantes, como o rim. Retraia suavemente a agulha. Transfira o embrião para um prato fresco contendo mídia embrionária e deixe-o se recuperar. Incubar o embrião por um período específico.

Poucas horas após a injeção, as nefrotoxinas se acumulam no rim e causam danos, levando a um declínio na função renal.

No dia da injeção, prepare a solução de nefrotoxina desejada com o controle apropriado do veículo. Vortex ou misture suavemente. Depois, verifique as laterais do tubo e a parte superior da coluna de água para garantir que os medicamentos sejam dissolvidos em solução.

Carregue uma agulha de microinjeção aparada com 2 a 3 microlitros de nefrotoxina enfiando uma ponta de carregamento de gel fino na parte de trás da agulha e suspenda a agulha verticalmente com um pedaço de fita adesiva para permitir que a solução preencha a ponta da agulha aparada por gravidade.

Quando a ponta da agulha estiver cheia, prenda a agulha carregada no micromanipulador. Teste o volume de microinjeção colocando uma gota de óleo mineral em uma lâmina micrométrica e injete no óleo para avaliar o tamanho da gota.

Em seguida, remova o prato de embriões da incubadora e anestesieste-os adicionando 5 mililitros de tricaína a 0,2% ao prato de embriões. Posteriormente, transfira os embriões para o molde de injeção com uma pipeta de transferência. Manobre cada embrião em um poço diferente do molde, colocando a cabeça na área mais profunda do poço, de modo que o tronco repouse ao longo da depressão e a cauda se projete para fora dele.

Agora, insira a agulha cheia no micromanipulador e posicione a ponta da agulha ao lado de um embrião. Insira suavemente a agulha na veia da cauda para microinjeção.

A etapa mais crítica do procedimento é a microinjeção. Para garantir o sucesso, a agulha deve ser cortada em um ângulo agudo e deve ser movida cuidadosamente para a posição ao lado do embrião.

Se a injeção for bem-sucedida, você deverá ver o líquido entrando na circulação. A co-injeção do nefrotóxico com dextrano conjugado com fluorescência permitiria ao pesquisador verificar o sucesso da injeção após o procedimento. Depois, remova suavemente a agulha do embrião.

Transfira o embrião para um prato limpo e enxágue para remover a Tricaína com E3 / PTU fresco. Em seguida, incube o embrião até o ponto de tempo desejado para avaliar a morfologia, que pode ser documentada por fotografia em meios de montagem de metilcelulose ou processo para análise experimental, conforme desejado.

Observe que a recuperação dos embriões deve ser avaliada a cada 12 a 24 horas após a injeção para determinar a porcentagem de indivíduos com edema, o que geralmente indica lesão renal.