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O rim de peixe-zebra adulto é uma estrutura translúcida localizada adjacente à parede dorsal do corpo do peixe. O rim exibe a presença de manchas pretas superficiais correspondentes aos melanócitos dispersos - células especializadas que protegem as células-tronco renais das radiações UV prejudiciais.
Para despigmentar e preparar o rim para a coloração, comece tomando um peixe-zebra adulto sacrificado. Mergulhe todo o peixe-zebra em uma solução fixadora adequada e incube pela duração desejada. A incubação permite que a solução fixadora penetre no corpo do peixe e trave os componentes do tecido no lugar.
Em seguida, coloque o peixe-zebra ventralmente e remova sua cabeça. Faça uma longa incisão ventral começando abaixo da região da cabeça e estendendo-se até a nadadeira caudal. Remova os órgãos para expor o rim subjacente. Usando uma pinça, retire o rim da parede dorsal e coloque-o em um frasco de vidro.
Trate o rim dissecado com uma concentração crescente de solução de sacarose. A solução de sacarose cria um ambiente isotônico que evita o encolhimento do rim. Posteriormente, incube o rim em uma solução clareadora para remover a pigmentação dos melanócitos. Isso ajuda na melhor visualização do rim durante outros procedimentos de coloração.
Por fim, substitua a solução de branqueamento por uma solução de bloqueio para bloquear locais indesejados e evitar manchas inespecíficas. O rim de peixe-zebra adulto despigmentado está agora pronto para as etapas de coloração subsequentes.
Quando estiver pronto, use uma pinça fina para separar cuidadosamente o rim da parede dorsal do corpo e coloque o órgão em um frasco de vidro. Lave o rim dissecado três vezes com 3 a 5 mililitros de 1x PBS com 0,05% Tween por 5 minutos cada.
Em seguida, remova a solução de PBS e enxágue o rim com 3 mililitros de uma solução de sacarose a 5% por 30 minutos. Após este tempo, substitua a solução por 3 mililitros de sacarose a 30% e armazene durante a noite a 4 graus Celsius.
No dia seguinte, retire a solução e lave o rim duas vezes antes de adicionar 3 a 5 mililitros de solução clareadora para remover a pigmentação dos melanócitos presente no órgão renal. Coloque o frasco de vidro em um rotador e observe cuidadosamente enquanto a pigmentação desaparece. A despigmentação normalmente leva aproximadamente 20 minutos, mas ocasionalmente pode levar até 60 minutos.
Se a solução clareadora for deixada por muito tempo, pode ocorrer desintegração e, portanto, é aconselhável monitorar a amostra a cada 10 a 15 minutos para verificar a integridade do tecido. Quando a pigmentação tiver sido removida do rim, lave duas vezes e incube com solução de PFA a 4% por 1 hora em temperatura ambiente.
Em seguida, remova a solução de PFA a 4% e lave o rim três vezes. Após a última lavagem, adicione 3 a 5 mililitros de solução bloqueadora e incube o rim em temperatura ambiente por 2 horas. Quando o bloqueio estiver concluído, prossiga diretamente para o protocolo de coloração selecionado.