Aspiração de fluidos de glomérulos de camundongos: um método para aspirar fluido glomerular de camundongos usando micropuntura mediada por dois fótons

No rim, o glomérulo - um feixe de pequenos vasos sanguíneos encerrados na cápsula de Bowman - inicia a filtragem do sangue e expele o fluido residual para o espaço de Bowman circundante. A investigação do conteúdo do líquido glomerular ajuda a entender a fisiologia renal.

Para aspirar o fluido glomerular, prepare um camundongo anestesiado com o rim exteriorizado cirurgicamente. Agora, injete corante fluorescente de dextrano nos vasos sanguíneos atrás da órbita ocular do camundongo. As moléculas fluorescentes de dextrano se movem pela corrente sanguínea e atingem o rim.

Devido ao alto peso molecular do dextrano, o corante fluorescente fica retido dentro do glomérulo, conferindo-lhe uma cor verde. Sob um microscópio de dois fótons, que permite a visualização de estruturas profundamente assentadas, localize um glomérulo adequado para obter acesso adequado ao fluido glomerular.

Em seguida, alinhe uma ponta de micropipeta revestida com nanopartículas fluorescente vermelha com o eixo lateral do rim. Usando um micromanipulador, avance a ponta da pipeta para penetrar no rim. À medida que a ponta atinge o glomérulo alvo, defina a taxa de aspiração desejada para aspirar o fluido glomerular do espaço de Bowman.

A ausência de fluorescência verde dentro da ponta da pipeta vermelha indica ausência de sangramento e confirma a aspiração bem-sucedida do líquido glomerular. Em seguida, retraia a pipeta e armazene o fluido em um tampão apropriado para análise posterior.

Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, aplique pomada nos olhos e use fita adesiva para imobilizar as extremidades de um camundongo adulto de 20 a 25 gramas. Use um creme depilatório para remover todos os pelos do lado esquerdo do animal e use o baço para localizar o rim esquerdo através da pele do lado dorsal e caudal do baço.

Faça uma incisão de 0,5 centímetro na pele, seguida por uma incisão menor no peritônio, grande o suficiente para que o rim seja empurrado. Expulse o rim com uma leve pressão e coloque um estabilizador renal de polissiloxano ao redor do tecido. Alinhe o rim com o espaçador de modo que a superfície mais lateral do rim se estenda além do estabilizador em cerca de 1 milímetro e fixe o rim na forma com adesivo de cianoacrilato. Cole uma placa de cabeça na forma do estabilizador e monte a placa de cabeça nas barras de montagem na placa de base.

Em seguida, preencha o poço no suporte de polissiloxano com solução de agarose a 1% e segure uma lamínula de 10 milímetros no topo da forma até que a agarose esteja firme. Sele a lamínula na placa da cabeça com cola e crie um anel ao redor da lamínula com cimento dental. Em seguida, injete 100 a 150 microlitros de FITC-dextrano retroorbitalmente e mova rapidamente o mouse e a placa de fixação para o estágio do microscópio de dois fótons.

Depois de focar manualmente na superfície do rim, mude para o modo de dois fótons sem varredura e explore a janela de imagem para localizar um glomérulo alvo maior que 30 micrômetros abaixo da lamínula e menos de 400 micrômetros da cápsula renal lateral. Registre a distância lateral e vertical até o glomérulo alvo. Em seguida, registre as coordenadas dos estágios x, y e z para o glomérulo e, por último, eleve o ponto focal da objetiva cerca de 1 milímetro na coluna d'água sem alterar as coordenadas dos estágios x e y.

Insira a ponta da pipeta na coluna de água e ligue a excitação DAPI. Mova a pipeta nas dimensões X e Y até o ponto de fluorescência máxima da ponteira. Este será o centro do objetivo. Altere a configuração de excitação para proteína fluorescente vermelha e visualize a pipeta com a ocular para permitir uma centralização precisa na visualização ocular.

Volte para dois fótons para encontrar a pipeta na visualização ao vivo de dois fótons e coloque a ponta precisamente no centro da imagem. Esta é a posição de registro. Em seguida, salve uma imagem da pipeta e registre a platina e as coordenadas do controlador da micropipeta. Remova a pipeta da coluna de água no eixo x sem mover os eixos y e z e mova a pipeta Z para a coordenada Z do glomérulo alvo e a borda do rim.

Observe o estágio X e calcule a pipeta de borda do rim X usando o deslocamento do estágio de registro, X. Aumente o estágio X para mover o estágio em direção à pipeta até que a borda do rim esteja bem à esquerda da tela, permanecendo visível. Avance rapidamente a pipeta para cerca de 100 micrômetros de distância da pipeta X da borda do rim, conforme calculado. Aumente o ganho vermelho e comece a avançar a ponta da pipeta lentamente até a borda do rim sob imagens ao vivo de dois fótons enquanto monitora o histograma de pixel vermelho.

Conduza a pipeta no eixo x lentamente até a pipeta alvo do glomérulo X, mantendo um olho no estágio X. Ao atingir o glomérulo, documente a posição com uma pilha Z. Com a pipeta na posição, configure a microbomba para injetar 100 nanolitros de perfluorodecalina durante 2 minutos para garantir a permeabilidade da pipeta e reduzir a confusão do entupimento da pipeta durante a entrada. Após 4 a 6 minutos de filtração, configure a microbomba para aspirar até 300 nanolitros a uma taxa de até 50 nanolitros por minuto.