Estudando Idade-dependente Instabilidade Genômica usando o S. cerevisiae Modelo Lifespan cronológica

O objetivo geral deste procedimento é estudar a instabilidade genômica dependente da idade em leveduras, combinando a vida útil cronológica com um conjunto de ensaios simples de danos e mutações no DNA. Isso é feito pela primeira amostragem de culturas de envelhecimento cronológico a cada dois dias e verificação da viabilidade por unidade formadora de colônia ou formação de UFC. O próximo passo do procedimento é examinar as mutações do DNA por meio de amostragem de culturas envelhecidas e células de plaqueamento em meio de seleção específico da mutação.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram mudanças nas mutações do DNA durante o envelhecimento cronológico da levedura por meio da normalização dos resultados do ensaio de mutação para a viabilidade. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do envelhecimento, como os mecanismos que ligam o envelhecimento e a instabilidade genômica na ária Para testar a vida útil cronológica da levedura ou CLS, primeiro inocule uma única colônia de levedura em um mililitro de glicose completa sintética ou meio SDC e incube durante a noite com agitação a 30 graus Celsius no dia seguinte. Dilua a cultura durante a noite em 10 mililitros de meio SDC fresco para um OD 600 de 0,05 a 0,1 incube com agitação a 30 graus Celsius por três dias.

No terceiro dia, quando as células estão em fase estacionária, dilua cada Eloqua 10.000 vezes em água de autoclave, remova duas alíquotas de 10 microlitros do frasco e coloque 10 microlitros de cada cultura diluída na placa AYEPD. Incube a placa a 30 graus Celsius até que surjam colônias. O número de colônias surgindo ou unidades formadoras de colônias a partir do terceiro dia de cultura é considerado 100% de sobrevivência.

Continue removendo alíquotas da cultura de envelhecimento nos dias subsequentes para o revestimento. Ajustar os fatores de diluição de acordo para garantir cerca de 20 a 100 colônias no ensaio de UFC. A amostragem é interrompida quando a viabilidade da cultura diminui abaixo de 1% normalmente entre os dias 11 e 13, a viabilidade celular também pode ser estudada em células envelhecidas em placas.

Para iniciar este ensaio, inocule uma única colônia em um mililitro de meio sintético de glicose completa e incube durante a noite com agitação a 30 graus Celsius. Quando a cultura tiver crescido para cerca de 10 a oito células por mililitro, dilua a cultura com água de autoclave para 100 a 200 células por 10 microlitros e 1000 células por 10 microlitros. Para cada cepa, prepare um conjunto de oito a 20 placas SDC de eliminação de triptofano rotuladas de acordo com a densidade de revestimento.

Para garantir que 10 a 100 colônias possam ser contadas em antecipação à diminuição da viabilidade durante o envelhecimento, coloque duas alíquotas de 10 a 30 microlitros de cultura diluída em cada placa. Incube a placa ajustada a 30 graus Celsius durante a análise da vida útil no dia do plaqueamento e a cada dois dias subsequentemente, remova uma placa e adicione gota a gota 0,5 mililitros de triptofano para permitir o crescimento de células viáveis. Incube a placa a 30 graus Celsius por mais 48 a 72 horas.

Após 48 a 72 horas. Conte a UFC para a viabilidade para o dia da edição do triptofano para testar quatro danos ao DNA e frequência de mutação durante o envelhecimento cronológico. Uma série de estranhos com características especiais são cultivados em paralelo com a cepa do tipo selvagem para o ensaio CLS de levedura.

A frequência de mutação espontânea pode ser avaliada medindo a frequência de resistência à canna vanning em uma cultura de envelhecimento cronológico. Mutações no gene can one que codifica a arginina permease plasmática tornam as células resistentes ao análogo da arginina L Canavan As células resistentes a Canavan crescerão na queda de arginina Placas médias completas sintéticas suplementadas com sulfato L Canavan medição da frequência de reversão positiva da viagem em uma cepa contendo uma mutação âmbar na viagem. Uma sequência de revestimento permite estimar a taxa de substituição de bases durante a viagem de envelhecimento cronológico da levedura.

As células de reversão positiva crescerão em placas de dropout de triptofano. A cepa negativa de lise EH one 50 abriga um deslocamento mais quatro no quadro de leitura aberto, o que resulta em atrofia do boi para lisina, e isso pode ser revertido por pequenas mutações de inserção ou deleção. Os reversores serão selecionados em placas de eliminação de lisina para detectar rearranjos cromossômicos macrossômicos ou gcr.

Uma cepa mutante é usada na qual HX T 13 localizado a 7,5 quilobases teloméricas para pode um no cromossomo cinco é interrompido por um U três mutações em em ambos os genes can one e U três tornam as células resistentes a L Canavan e cinco ácido fluororótico, respectivamente. Como a frequência de mutações pontuais que ocorrem em ambos os genes é baixa, a análise da frequência de resistência ao ácido fluororótico El Canavan e cinco fluoro fornece uma estimativa de gcr para monitorar o nível de recombinação homóloga e homóloga. Durante o envelhecimento cronológico, são gerados mutantes que carregam repetições invertidas 100% homólogas ou 91% homólogas.

IRS na sua recombinação de três locus entre o IRS permite a expressão de suas três proteínas funcionais. Portanto, as células nas quais ocorreu a recombinação crescerão em placas de eliminação de histidina suplementadas com galactose. No terceiro dia, quando as células estão em fase estacionária e a quantidade adequada de células será removida de cada cultura de envelhecimento.

Como o mesmo procedimento é usado para todos os ensaios, apenas uma amostra será processada. Para o propósito deste vídeo, faça a pelota das células girando em uma centrífuga de bancada. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de pellet de água em autoclave.

Novamente, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de células da placa de água nas placas apropriadas para selecionar as reversões desejadas. Incubar placas a 30 graus Celsius após três a quatro dias contar UFCs, a frequência de mutação é normalizada para o número de células viáveis. Este gráfico mostra resultados representativos de um ensaio de vida cronológica típico quando a sobrevivência cronológica de células selvagens é comparada com a de S CH nove delta TOR um delta e RAs dois mutantes delta.

Em cultura líquida, mutantes sem TOR um s, CH nove ou RAs dois mostram uma vida cronológica estendida. Além disso, deficiências em s CH nove e RAs dois mostram um efeito aditivo na promoção da longevidade na sobrevivência cronológica na presença de várias fontes de carbono. O uso do ensaio de viabilidade NC dois é mostrado no próximo gráfico.

No primeiro dia, as culturas do tipo selvagem SDC foram diluídas e semeadas em placas de saída de viagem SC sem fonte de carbono. As placas de dropout SC Tripp suplementadas com placas de glicose, etanol ou orratos de glicerol foram incubadas a 30 graus Celsius a cada dois dias. Uma placa foi recuperada de cada conjunto e nutrientes apropriados foram adicionados para permitir o crescimento e a formação de colônias.

A frequência de mutação dependente da idade varia muito, dependendo da cepa, histórico, manipulação genética, cultura, condições e idade. Esta tabela mostra os resultados típicos obtidos em uma cepa do tipo selvagem. Os resultados representativos da síntese de lesões trans são mostrados na próxima imagem.

O aumento da frequência de mutação dependente da idade pode envolver alterações no reparo errôneo do DNA usando extratos nucleares e vários modelos de DNA. Podemos avaliar a síntese de tradução ou TLS nas células cronologicamente envelhecidas. Extratos nucleares de células mutantes delta de fase estacionária de três dias, tipo selvagem e SCH nove foram analisados.

Os produtos TLS com gabarito não danificado são indicados por linhas sólidas e os produtos TLS com gabarito danificado são indicados por linhas pontilhadas. Não foi observada síntese de lesão trans em extratos nucleares do CH de longa duração nove primers livres de mutantes delta são indicados pela seta aberta. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a análise cronológica da vida útil e da mutação do DNA em leveduras.