Name: Estudando Idade-dependente Instabilidade Genômica usando o S. cerevisiae Modelo Lifespan cronológica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a estudar instabilidade genômica dependente da idade em Saccharomyces cerevisiae usando ensaios de mutação e análise de viabilidade. Este método permite investigar genes e vias envolvidos na instabilidade do DNA durante o envelhecimento.

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Agradecemos a S. Robertson Jinks e E. Heidenreich para a prestação de plasmídeos e cepas de leveduras; P. Pham e MF Goodman para ajudar ensaio TLS withthe. Este trabalho foi financiado, em parte, pela Federação Americana de Aging Research concessão e pelo NIH AG20642, AG025135.

Dois modelos de vida têm sido usados ​​para estudar o envelhecimento em S. cerevisiae: RLS e CLS. A expectativa de vida replicativa (brotamento) (RLS) é baseada na observação de que as células de levedura mãe passar por um número finito de divisões 3-6. Vamos concentrar-nos na vida cronológica (CLS), um modelo baseado na sobrevivência cronológica de levedura não-divisão na cultura ou em placas de 7-11. Levedura tipo selvagem cresce exponencialmente por 10-12 horas em meio sintético dextrose (SDC) completo . Quando o nível de glicose reduz, switches levedura da fermentação para a respiração, um processo denominado mudança diauxic. As células continuam a dividir lentamente durante a fase de pós-diauxic por aproximadamente 48 horas antes de entrar no G prisão 0. A taxa metabólica das células mantém-se elevada até o dia 06/05 (dia 0 é o dia da inoculação). Viabilidade celular ao longo do tempo pode ser acessado pela porcentagem de células em ordem cronológica de envelhecimento, amostrados a cada dois dias, o que pode sair do G parada 0 e forma colônias em placas YPED ricos. 1. Levedura cronológica vida (CLS) em cultura líquida <ol><li> Inocular uma única colônia em uma média de glicose ml sintéticos completa (SDC, Tabela 1) e incubar durante a noite com agitação (220 rpm) a 30 ° C. Três colônias independentes de inóculo deve ser preparado para cada cepa para fornecer réplicas biológicas. </li><li> Diluir a cultura durante a noite em meio SDC fresco (normalmente 10 ml) para OD = 0,05-0,1 (~ diluição 1:100) e incubar com agitação (220 rpm) a 30 ° C. Este ponto é considerado o tempo 0 dia do envelhecimento cronológico. Manter uma relação de 1:5 de Cultura / frasco de volume (10 ml de cultura em 50 ml, ou para experiências mais / grande 25 ml de cultura em 125 ml) para garantir a aeração adequada. </li><li> A partir do dia 3, remover duas alíquotas de 10 ml do frasco, diluir 10 mil vezes em água esterilizada, 10 mL da cultura diluída (ie, 10 4 -10) em YEPD (extrato de levedura 1%, 2% Bacto peptona, dextrose 2% , 2% agar) placas e incubar a 30 ° C durante 48-72 horas antes de se unir formadoras de colônia (UFC) é contado. </li><li> Dia 3 UFC é considerado de sobrevivência de 100%. Fatores de diluição da cultura de envelhecimento nos dias subseqüentes devem ser ajustadas de acordo para garantir ~ 2-10 colônias no ensaio UFC (por exemplo, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, etc.) Para as células do tipo selvagem no fundo DBY746, o CLS chega a sobrevivência de 1% por volta do dia 11. </li></ol> Variações no ensaio de viabilidade situ incluem: <ul><li> Restrição calórica (CR) por limitação de glicose. Diluição da cultura durante a noite em meio de glicose SC limitada (como 0,5 ou 0,05%, em vez da glicose padrão de 2%) conduzem geralmente a menor densidade de população de saturação no dia 3, mas muito estendida média e máxima (10% de sobrevivência) vida útil 12. </li><li> Para CR extremo / fome, lavar o dia 3 de cultura fase estacionária (geralmente 10 ml, como no passo 3 acima) com água autoclavada (células ressuspender em igual volume de água e girar a 2500 rpm por 5 min, repetir 3 vezes). Células Incubationof em água imita a condição de fome que a levedura pode encontrar na natureza. A cada dois dias, posteriormente, cultura de envelhecimento devem ser lavadas com água autoclavada e ressuspenso em igual volume de água para remover todos os nutrientes liberados lisadas células mortas. Realizar ensaios por amostragem viabilidade da cultura do envelhecimento, como descrito acima. Esta condição de fome será levado a quase duplicação do CLS significa na estirpe selvagem DBY746 12. </li></ul> 2. Viabilidade no ensaio in situ Na cultura líquido, uma pequena fração das células sobreviventes podem re-entrou no ciclo celular e crescer utilizando demais nutrientes ou aqueles forma liberado lisadas células mortas no meio, um fenótipo denominado regrowth / ofegante 13. Nós desenvolvemos um sistema de viabilidade-on-a-placa que utiliza a auxotrophy da cepa DBY746 (trp1) para contornar a rebrota / gasping problema e também permitem testar o efeito da exposição constante ou privação de nutrientes diversos estímulos externos ou em levedura CLS 11. Este ensaio de viabilidade em situ também imita a vida replicativa modelo de tal forma que as células estão constantemente expostos aos nutrientes abundantes para a duração da análise de ciclo de vida. <ol><li> Inocular uma única colônia em uma média de glicose ml sintéticos completa (SDC) e incubar durante a noite com agitação (220 rpm) a 30 ° C. Pelo menos três inóculo de colônias independentes devem estar preparados para cada cepa para fornecer réplicas biológicas. </li><li> Deixe a cultura a crescer para ~ 10 8 células / ml (OD 600 = ~ 10), diluir a água culturewith autoclavado a 100-200 mL cell/10 (geralmente 10 a diluição de 4 vezes) e 1.000 cells/10 mL (10 3 vezes de diluição). </li><li> Placa de duas alíquotas de 10-30 mL da cultura diluída em uma placa de triptofano SDC abandono. Parar cada cepa, preparar um conjunto de 8 a 20 placas e rotulado de acordo com a densidade de revestimento (por exemplo, 10 4 vezes diluída, placa de 10 ml ou 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 , etc), que garantem 10-100 colônias podem ser contados em antecipação de viabilidade diminuiu durante o envelhecimento. </li><li> Incubar a placa fixada em 30 ° C para a duração da análise de ciclo de vida. </li><li> No dia de revestimento e subsequentemente a cada 2 dias, remover uma placa e adicionar gota a gota, 0,5 ml triptofano (2 mg / ml) para permitir que as células viáveis ​​para crescer. Incubar as placas a 30 ° C por mais 48-72 horas. Conte o UFC para a viabilidade no dia da adição de triptofano. O UFC no dia do chapeamento é considerado de sobrevivência de 100%. </li></ol> Variações no ensaio de viabilidade situ incluem: <ul><li> Idade células em placas de agar (condição extrema de fome). Adicionar 1 ml 2x YPED em vez de triptofano em dias subseqüentes para permitir o crescimento e CFU contar 14. </li><li> Células idade em placas com meio sintético triptofano abandono completo com várias fontes de carbono, por exemplo, diferentes concentrações de glicose (restrição calórica por limitação de glicose), várias fontes de carbono, como etanol, glicerol, ácido acético 14. Adicionar 1 ml de glicose / solução de triptofano (glicose 20% e 1mg/ml triptofano) para permitir o crescimento e contagem de UFC. </li><li> Manipulação de outros nutrientes, como nitrogênio. </li></ul> 3. Danificar o DNA e frequência de mutação durante o envelhecimento cronológico Canavanina resistência (Can r) e CAN1 seqüenciamento Frequência de mutação espontânea pode ser avaliada através da medição da freqüência de resistência canavanina (Can r) em culturas cronologicamente envelhecimento. Mutações no gene CAN1 (YEL063), que codifica a arginina plasma permease, render células resistentes à arginina analógico colônias L-canavanine.Can r coletadas em momentos diferentes também podem ser salvos para a extração do DNA genômico e seqüenciamento subseqüente do CAN1 gene, que pode fornecer dados de mutação do espectro (com Surveyor Mutação, SoftGenetics). Substituições de base (Trp + reversões) Estirpes com trp1-289 contém uma mutação âmbar (C403T) na seqüência TRP1 codificação. Medição da freqüência de trp1-289 para a reversão Trp + 15 permite a estimativa da taxa de substituição de base durante o envelhecimento cronológico levedura. Quadro de mudança de mutações A Lys - estirpe EH150 (MATA, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) abriga uma mutação II lys2ΔBgl que foi construído através da inserção de quatro nucleotídeos para criar um site de Bgl II enzima de restrição no gene LYS2 . O resultado quatro mudança nos resultados de leitura aberta quadro no auxotrophy para a lisina, que pode ser revertida por pequenos inserção / deleção mutações 16-17. Gross rearranjos cromossômicos (RCG) Para detectar rearranjos cromossômicos bruta (RCG), geramos uma estirpe mutante, em que HXT13 (YEL069), codificação de um transportador de hexose altamente redundante, foi interrompido por uma cassete URA3 18. HXT13 está localizado a 7,5 kb telomérica CAN1 no cromossomo V. Mutações em ambos os CAN1 e URA3 genes de resistência tornam células L-canavanina e 5-fluoroorotic ácido (5FOA), respectivamente. Considerando a baixa freqüência de mutações pontuais que ocorrem em ambos os genes, a análise da possível r 5FOA r freqüência fornece uma estimativa da RCG, que resultam na perda de dois genes. Recombinação homóloga e homeologous Para monitorar o nível de homólogos (100%) e recombinação homeologous (91%) durante o envelhecimento cronológico, geramos mutantes em que plasmídeos linearizados (HIS3:: intron-IR-URA3) carregando ou 100% repete homóloga invertida (IRs) (pSR406 ) ou 91% homeologous IRs (pSR407) no locus HIS3 19. Recombinação entre os IRs permite a expressão da proteína His3 funcional. <ol><li> Em paralelo ao ensaio de viabilidade normal (como descrito acima), retire uma quantidade adequada de células a partir da cultura de envelhecimento, <ol><li> para pode r mutação, comece com ~ 2x10 7 células (200 mL de cultura dia 3); </li><li> para Trp + reversão, começa com ~ 10 8 células (500-1000 mL da cultura dia 3); </li><li> de Lys + mutação quadro-shift, começar com ~ 10 8 células (500-1000 mL da cultura dia 3); </li><li> para RCG, comece com 2-3x10 8 células (2-3 ml da cultura 3 dias); </li><li> para recombinação homóloga e homeologous, e começar com til; 5x10 7 células (200-500 mL de cultura dia 3); </li></ol> ajustar a quantidade de revestimento de acordo com a diminuição da viabilidade total e aumento da frequência de mutação durante o envelhecimento cronológico (Tabela 2). Em caso de cepas com fenótipo hypermutator (tais como aqueles com deficiências no reparo do DNA), reduzir a quantidade de amostragem em conformidade. </li><li> Sedimentar as células com bancada máquina de centrifugação (6000 rpm por 5 min). </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de água esterilizada, e agregar as células novamente. </li><li> Ressuspender celular em 100 l de água. Células da placa, <ol><li> para pode r mutação, em arginina abandono-sintético placas médio completo (SDC-Arg, suplementada com 60 mg / ml de sulfato de L-canavanina); </li><li> para Trp + reversão, em triptofano abandono placas (SDC-Trp); </li><li> de Lys + mutação quadro-shift, em lisina abandono placas (SDC-Lys); </li><li> para RCG, em arginina abandono placas (SDC-Arg), suplementado com 5FOA (1 mg / ml) e L-canavanina sulfato (60 mcg / ml); </li><li> para recombinação homóloga e homeologous, em histidina abandono placas suplementado com galactose (2%). </li></ol></li><li> Contagem de UFC após incubação de 3-4 dias 'a 30 ° C. A frequência de mutação é normalizado para o número de células viáveis. </li></ol> Complementares para o ensaio de viabilidade em situ, dependente da idade Trp + reversão, Lys + shift-quadro de mutação, recombinação, ou pode r também pode ser estudado em células envelhecidas na placa. <ol><li> Células da placa (~ 10 8 células / placa) para Trp, Lys, sua desistência, ou L-canavanina sintéticos placas médio completo (como descrito acima). </li><li> A cada dois dias (ou no ponto de tempo de interesse), a pontuação das colônias recém-emergentes. </li><li> Frequência de mutação é estimada através da normalização colônias emergentes para o número total de células viáveis ​​do dia específico. </li></ol> 4. Síntese Translesion (TLS) A idade-dependente aumentar a frequência de mutação pode envolver mais de dano macromolécula, proteção celular diminuída / reparo, e aumentou o reparo do DNA errônea (como Polζ dependentes de síntese translesion, TLS) durante o envelhecimento. Por exemplo, a longa duração mutantes SCH9 Δ apresentam expressão elevada de SOD2, e diminuição da expressão da enzima propenso a erros de reparo do DNA Rev1 20. Aqui nós descrevemos um ensaio que combina template DNA danificado e extrair todo nuclear para avaliar a TLS in vitro. <ol><li> Preparar o extrato nuclear, como descrito por Wang et al 21;. Quantificar a concentração de proteína pelo BCA ensaio (Pierce). </li><li> Adicionar 0, 5, 10 ou 20 mg de extratos nucleares para 50 ul (volume final) reações contendo TLS tampão (20 mM HEPES, 7 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 e 100 nM μMdNTPs 5'-32 P-12-mer rotulados primer (5'-TGG TAC CGA GGA-3 ') recozido para um modelo de 48 mer contendo o dano ao DNA de interesse (5'-ATA TCG CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA TCG CCA-3 ', em que X é o local danificado, por exemplo, abasic site, 8-oxo-G, etc.) </li><li> Incubar a mistura a 30 ° C por 30 min, terminar a reação com a adição de 2,5 mL de EDTA (20 mM) e 2 mL de proteinase K (10 mg / mL). </li><li> Purificar DNA com a extração de fenol e precipitação de etanol. </li><li> Ressuspender o DNA em 50 ul de gel de tampão de carregamento (98% formamida, 20 mM EDTA, e corante). </li><li> Resolve os produtos de síntese translesion em géis de poliacrilamida 19%. </li><li> Quantificar o TLS usando phosphorimaging (Figura 1). </li></ol> 5. Resultados representante Nós normalmente utilizado a contagem de UFC no dia 3 de 100 por cento de sobrevivência na análise CLS padrão líquido. A sobrevivência percentual nos dias subseqüentes podem ser equipados para calcular a média (50% de sobrevivência) e máximo de vida (10% de sobrevivência) abrange 12. Tempo de vida resultados obtidos a partir do ensaio de viabilidade em situ são geralmente consistentes com aqueles utilizando o ensaio CLS líquido, mas com redução da expectativa de vida média, que é devido em parte ao fato de que as células estão constantemente expostos aos nutrientes. Presença de glicose inibe a atividade de proteção celular como mostrou pela transativação redução de estresse fator de transcrição de resposta, como MSN2 / 4 e Gis1 12. Idade-dependente frequência de mutação varia muito, dependendo da tensão de fundo, a manipulação genética, condições de cultura e idade. A Tabela 2 mostra os resultados típicos obtidos na cepa do tipo selvagem (DBY746). <table border="1"><tbody><tr><th> Componente </th><th> g / L </th></tr><tr><td> D-glucose </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Sulfato de amônio </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Nitrogênio base (-AS/-AA) </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> NaH2PO4 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td></td><td> mg / L </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Arginina </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Ácido L-aspártico </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Ácido L-glutâmico </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Histidina </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-isoleucina </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> 120 </td></tr><tr><td> L-Lisina </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Metionina </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Fenilalanina </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Serina </td><td> 400 </td></tr><tr><td> L-Treonina </td><td> 200 </td></tr><tr><td> L-Triptofano </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Tirosina </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-valina </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 80 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Médias de glicose sintética completa, SDC (ajustar para pH 6,0 com NaOH). 4 vezes o excesso de histidina, leucina, triptofano e uracila são incluídos para compensar a auxotrophy da cepa DBY746. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Dia 3 (média ± SEM) </th><th> Até (durante o envelhecimento) </th></tr><tr><td> Pode r </td><td> 1,76 ± 0,12 x10 -6 </td><td> 08/06 x10 -6 </td></tr><tr><td> Trp + reversão </td><td> 6,60 ± 1,70 x10 -8 </td><td> 1,60 x10 -6 </td></tr><tr><td> Lys + mutação quadro-shift </td><td> 3,00 ± 0,78 x10 -8 </td><td> 0,70 x10 -6 </td></tr><tr><td> RCG </td><td> 0,62 ± 0,10 x10 -8 </td><td> 0,30 x10 -6 </td></tr><tr><td> Recombinação homóloga </td><td> 5,55 ± 2,74 x10 -6 </td><td> 27,00 x10 -6 </td></tr><tr><td> Recombinação Homeologous </td><td> 0,12 ± 0,04 x10 -6 </td><td> 0,48 x10 -6 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Freqüências de mutação típica de células de tipo selvagem (DBY746) durante o envelhecimento cronológico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3030/3030fig1.jpg"> Figura 1. Resultado da síntese translesion (TLS) 20. Extratos nucleares de 3 dias de idade, fase estacionária do tipo selvagem (DBY746) e células SCH9 Δ mutante foram incubadas com ou sem danos abasic modelos de site contendo DNA por 30 min a 30 ° C. TLS produtos são indicados por sólidos (com modelo sem danos) ou pontilhado (com modelo danificado) linhas. Não houve síntese translesion observado no extrato nuclear de SCH9 mutantes Δ. Primers livre são indicados pela seta aberta.

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<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1%2FPolzeta-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2%2FMsn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li>
<li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner%2FBloom+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Líquido culturas envelhecimento exibem algum regrowth / fenótipo ofegante 13, o que complica a análise CLS. Rebrota normalmente ocorre quando mais de 90-99% da população perdeu viabilidade. Este fenótipo é freqüentemente associada com aumento do estresse oxidativo e / ou protecção diminuição na célula. Por exemplo, a freqüência desse fenótipo mais do que duplica em células falta superóxido dismutase citosólica e reduz em longa vida mutantes (por exemplo, SCH9 Δ ou Δ RAS2) ou mutantes superóxido superexpressão superóxido 22. Na prática, nós definimos rebrota como um aumento na viabilidade ou estabilização da viabilidade de três amostragens consecutivas na fase de alta taxa de mortalidade durante o envelhecimento cronológico. Dependente da idade as freqüências de mutações no DNA diferentes variam muito, dependendo da tensão de fundo, a manipulação genética, condições de cultura, bem como regrowth / ofegante e sobrevivência extremamente baixa. Pré-experimentos devem ser realizados em momentos como a sobrevida média e máxima com densidade chapeamento de vários ensaios de mutação para a determinação da faixa de freqüência de mutação antes performingthe completa análise de tempo de escala de vida. A cepa selvagem deve sempre ser incluídos em um tempo de vida ou de estudo de frequência de mutação em paralelo a qualquer tratamento ou mutantes genéticos, de tal forma que experimento inter-variações podem ser contabilizados. Múltiplas réplicas biológicas devem ser incluídos no estudo, e, tanto líquido e in situ viabilidade / mutação ensaios devem ser realizados para confirmar os resultados. Em vez de focar em um tipo específico de mutação do DNA, o perfil de idade-dependente instabilidade genômica usando múltiplos ensaios em combinação, podem lançar luz sobre danos no DNA específico e sistema de reparo do DNA dano (s) que contribuem para a idade-dependente instabilidade genômica. Por exemplo, um aumento significativo em bruto rearranjos cromossômicos (RCG), em comparação aos de outras mutações no DNA, é observada na levedura do tipo selvagem, sugerindo uma pausa vertente elevationof dupla e / ou um prejuízo no não-homólogos final juntar (NHEJ) durante a levedura envelhecimento cronológico (Tabela 2). O espectro de mutação CAN1 (seqüenciamento do gene CAN1) obtidos na levedura de envelhecimento do tipo selvagem sugeriu um aumento no dano oxidativo durante o envelhecimento cronológico e propenso a erros de reparo do DNA e que, em vida longa SCH9 mutantes Δ, dano oxidativo e de DNA muito reduzido propenso a erros síntese translesion foram observados 20. Métodos descritos aqui podem ser ainda mais gastos para estudar a idade-dependente instabilidade genômica. Por exemplo, as células quiescentes e não em repouso pode ser isolado de levedura fase estacionária de culturas usando o método de gradiente de densidade descrito por Allen et al. 23. Combinado com a ensaios de mutação descrita aqui, temos verificado que uma parcela grande de idade-dependente mutações surge a partir de células quiescentes, em vez da divisão, as células danificadas ou apoptose 20,24.

estudando idade-dependente instabilidade genômica usando o s. cerevisiae modelo lifespan cronológica

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Estudos utilizando o modelo Saccharomyces cerevisiae envelhecimento descobriram caminhos tempo de vida de regulamentação que estão parcialmente conservados em eucariotos superiores 1-2. A simplicidade eo poder do modelo de fermento de envelhecimento também pode ser explorado para o estudo de danos ao DNA e manutenção do genoma, bem como suas contribuições para doenças durante o envelhecimento. Aqui, descrevemos um sistema para estudar as mutações idade-dependente de DNA, incluindo substituição de base, mudança de quadro de mutações, rearranjos cromossômicos bruta, e homóloga / recombinação homeologous, bem como atividade de reparo de DNA nuclear, combinando o fermento esperança de vida cronológica com DNA simples danos e ensaios de mutação. Os métodos descritos aqui devem facilitar a identificação de genes / vias que regulam a instabilidade genômica e os mecanismos que estão por trás mutações idade-dependente e câncer de DNA em mamíferos.

Aqui nós descrevemos um conjunto de ensaios de mutação de DNA que podem ser combinados com o fermento modelo de extensão cronológica vida ao estudo dos genes / vias que regulam ou contribuir para a instabilidade do DNA genômico durante o envelhecimento.

Estudando Idade-dependente Instabilidade Genômica usando o S. cerevisiae Modelo Lifespan cronológica

Estudos utilizando o modelo de envelhecimento de *Saccharomyces cerevisiae* revelaram vias reguladoras da longevidade que são parcialmente conservadas em eucariotos superiores1-2. ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a instabilidade genômica dependente da idade em leveduras, combinando a longevidade cronológica com um conjunto de ensaios simples de dano ao DNA e mutação. Isso é realizado primeiramente coletando amostras de culturas envelhecidas cronologicamente a cada dois dias e verificando a viabilidade por meio da formação de unidades formadoras de colônias ou CFU. O próximo passo do procedimento é examinar as mutações no DNA coletando amostras de culturas envelhecidas e plaqueando células em meio de seleção específico para mutações.Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram alterações nas mutações de DNA durante o envelhecimento cronológico de leveduras, normalizando os resultados do ensaio de mutação pela viabilidade. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do envelhecimento, como os mecanismos que ligam envelhecimento e instabilidade genômica. Para realizar o ensaio de longevidade cronológica de leveduras, ou CLS, primeiramente inocular uma única colônia de levedura em um mililitro de meio sintético completo com glicose, ou meio SDC, e incubar durante a noite com agitação a 30 graus Celsius. No dia seguinte, diluir a cultura noturna em 10 mililitros de meio SDC fresco para uma OD 600 entre 0,05 e 0,1 e incubar com agitação a 30 graus Celsius por três dias.No terceiro dia, quando as células estiverem em fase estacionária, dilua cada cultura Eloqua 10.000 vezes em água autoclavada, em seguida retire duas alíquotas de 10 microlitros do frasco e plaque 10 microlitros de cada cultura diluída em placa A-Y-E-P-D. Incube a placa a 30 graus Celsius até o surgimento de colônias. O número de colônias formadas, ou unidades formadoras de colônia, provenientes da cultura do terceiro dia é considerado como 100% de sobrevivência.Continue removendo alíquotas da cultura envelhecida nos dias subsequentes para plaqueamento. Ajuste os fatores de diluição conforme necessário para garantir cerca de 20 a 100 colônias no ensaio de UFC. A coleta de amostras é interrompida quando a viabilidade da cultura diminui abaixo de 1%; tipicamente entre os dias 11 e 13, a viabilidade celular também pode ser estudada em células envelhecidas em placas.Para iniciar este ensaio, inocular uma colônia isolada em um mililitro de meio sintético completo com glicose e incubar durante a noite com agitação a 30 graus Celsius. Quando a cultura tiver crescido até cerca de 10 elevado à oitava células por mililitro, diluir a cultura com água autoclavada para 100 a 200 células por 10 microlitros e 1000 células por 10 microlitros. Para cada linhagem, preparar um conjunto de oito a 20 placas de SDC sem triptofano rotuladas de acordo com a densidade de semeadura.Para garantir a contagem de 10 a 100 colônias, antecipando a diminuição da viabilidade durante o envelhecimento, plaque dois alíquotas de 10 a 30 microlitros de cultura diluída em cada placa. Incube o conjunto de placas a 30 graus Celsius durante toda a análise de longevidade; no dia do plaqueamento e a cada dois dias subsequentemente, retire uma placa e adicione gota a gota 0,5 mililitros de triptofano para permitir o crescimento das células viáveis. Incube a placa a 30 graus Celsius por mais 48 a 72 horas.Após 48 a 72 horas. Conte as UFC para a viabilidade do dia da adição de triptofano para ensaiar quatro danos ao DNA e frequência de mutação durante o envelhecimento cronológico. Vários mutantes com características especiais são cultivados em paralelo com a linhagem selvagem para o ensaio de CLS de levedura.A frequência de mutação espontânea pode ser avaliada pela medição da frequência de resistência à canavanina em uma cultura envelhecida cronologicamente. Mutações no gene can1, que codifica a permease de arginina de membrana plasmática, tornam as células resistentes ao análogo de arginina L-canavanina. Células resistentes à canavanina crescerão em placas de meio sintético completo sem arginina, suplementadas com sulfato de L-canavanina. A medição da frequência de reversão trip+, em uma linhagem que contém uma mutação âmbar no gene trp1, permite a estimativa da taxa de substituição de bases durante o envelhecimento cronológico da levedura.Células com reversão positiva crescerão em placas sem triptofano. A linhagem lyse negativa EH um 50 possui uma mudança de quadro de leitura de mais quatro, que resulta em auxotrofia para lisina, e isso pode ser revertido por pequenas inserções ou deleções. Os revertentes serão selecionados em placas sem lisina para detectar rearranjos cromossômicos grossos ou gcr.Uma linhagem mutante é utilizada, na qual o HX T 13 localizado a 7,5 quilobases telomérica ao can um no cromossomo cinco é interrompido por um cassete U três. Mutações nos genes can um e U três tornam as células resistentes à L-canavanina e ao ácido 5-fluoroorótico, respectivamente. Como a frequência de mutações pontuais que ocorrem em ambos os genes é baixa, a análise da frequência de resistência à L-canavanina e ao ácido 5-fluoroorótico fornece uma estimativa de GCR. Para monitorar o nível de recombinação homóloga e não homóloga, durante o envelhecimento cronológico são gerados mutantes que carregam repetições invertidas homólogas de 100% ou de 91% de homologia.A IRS no locus his três permite a recombinação entre a IRS, possibilitando a expressão da proteína funcional his três. Assim, as células nas quais ocorreu recombinação crescerão em placas sem histidina suplementadas com galactose. No terceiro dia, quando as células estiverem na fase estacionária, uma quantidade apropriada de células será removida de cada cultura envelhecida.Como o mesmo procedimento é utilizado para todos os ensaios, apenas uma amostra será processada. Para fins deste vídeo, pelletize as células por centrifugação em uma centrífuga de bancada. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de água autoclavada.Novamente, remova o sobrenatante e ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de água; plaque as células em placas apropriadas para seleção dos reversões desejadas. Incube as placas a 30 graus Celsius e, após três a quatro dias, conte as UFCs; a frequência de mutação é normalizada em relação ao número de células viáveis. Este gráfico mostra resultados representativos de um ensaio típico de longevidade cronológica, no qual a sobrevivência cronológica de células selvagens é comparada à de mutantes S. cerevisiae ΔTOR1 e ΔRAS2.Em cultura líquida, mutantes que carecem de TOR um, CH nove ou RAs dois apresentam uma longevidade cronológica prolongada. Além disso, deficiências em s CH nove e RAs dois mostram um efeito aditivo na promoção da sobrevivência cronológica na presença de várias fontes de carbono. A utilização do ensaio de viabilidade NC dois é mostrada neste próximo gráfico.No primeiro dia, culturas selvagens de SDC foram diluídas e semeadas em placas SC triplo dropout sem fonte de carbono. As placas SC triplo dropout suplementadas com glicose, etanol ou glicerol foram incubadas a 30 graus Celsius, com análise a cada dois dias. Uma placa foi retirada de cada conjunto e os nutrientes apropriados foram adicionados para permitir o crescimento e a formação de colônias.A frequência de mutação dependente da idade varia bastante conforme a linhagem, background, manipulação genética, cultura, condições e idade. Esta tabela mostra resultados típicos obtidos em uma linhagem selvagem. Os resultados representativos da síntese translesão são mostrados nesta próxima imagem.O aumento da frequência de mutações dependente da idade pode envolver alterações na reparação incorreta do DNA utilizando extratos nucleares e diversos modelos de DNA. Podemos avaliar a síntese de translesão ou TLS em células envelhecidas cronologicamente. Extratos nucleares de células de fase estacionária com três dias de idade, do tipo selvagem e do mutante SCH nove delta foram analisados.Produtos de TLS com molde não danificado são indicados por linhas contínuas e produtos de TLS com molde danificado são indicados por linhas tracejadas. Não foi observada síntese translesão em extratos nucleares do mutante longevo s CH nine delta; os iniciadores livres são indicados pela seta aberta. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a análise do tempo de vida cronológico e de mutação do DNA em leveduras.

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Biology

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