Nocaute de gene mediado por RNA de grampo curto em iHSPCs in vitro: um sistema de expressão de shRNA baseado em lentivírus em iHSPCs para knockdown de expressão gênica específica

Comece com uma célula-tronco hematopoiética imortalizada e célula progenitora, iHSPC, cultura em meio contendo hormônio esteróide específico e citocina hematopoiética, regulando a proliferação celular em um estado indiferenciado. Adicionar um polímero catiónico adequado e vectores lentivirais.

Os vírus recombinantes carregam sequências de codificação para RNAs de grampo curto, shRNAs, direcionados para um gene específico do hospedeiro e gene marcador de resistência a antibióticos.

Centrifugue para sedimentar células e vírus. Durante a incubação, os polímeros catiônicos neutralizam as cargas da membrana celular, aumentando a ligação viral. Após a fusão da membrana, o material genético viral e as enzimas são liberados no citoplasma celular. O genoma viral é transcrito reversamente, move-se para o núcleo e se integra ao genoma do hospedeiro.

Sob a influência de um promotor específico na construção, a construção do gene shRNA compreendendo uma sequência de correspondência de mRNA alvo, segmento de alça e outra sequência complementar à primeira, é transcrita formando shRNA com segmento de alça de nucleotídeos desemparelhados. Após a transcrição, o shRNA é exportado para o citoplasma.

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