Edição do genoma CRISPR tudo-em-um: um método para knock-in de gene baseado em reparo dirigido por homologia em células cultivadas usando o sistema CRISPR-Cas9

Comece adicionando plasmídeo CRISPR tudo-em-um às células imunes presentes em um tubo. Este plasmídeo contém um gene Cas9 em combinação com o sgRNA ou sequência codificadora de RNA de guia único, complementar à sequência alvo no genoma do hospedeiro.

Adicione um plasmídeo doador linearizado contendo um transgene imprensado entre braços de homologia ou HAs - as repetições de DNA necessárias para a recombinação homóloga. Realize a eletroporação, que usa corrente elétrica para injetar a mistura de plasmídeos na célula. Uma vez dentro, o sgRNA processado forma um complexo com a nuclease Cas9 expressa.

O sgRNA se liga ao local alvo, permitindo que a nuclease Cas9 identifique a sequência de reconhecimento específica conhecida como motivo adjacente ao protoespaçador ou PAM e clive o DNA do hospedeiro próximo a ele. Isso cria uma quebra de fita dupla sem corte, onde a maquinaria celular resseca o DNA, gerando saliências de 3 '. A presença de locais flanqueadores de HA desencadeia o mecanismo de reparo dirigido por homologia, onde o DNA cortado se junta à sequência HA, formando uma estrutura heteroduplex - a alça D.

A síntese de DNA continua, formando uma fita complementar à sequência transgênica até que ela se junte à fita de DNA original. A parte superior do D-loop atua como um modelo para sintetizar a parte que falta do DNA, gerando as junções duplas de Holliday - estruturas onde quatro fitas de DNA interagem. Essas junções se resolvem e as lacunas se reparam, facilitando a inserção do gene alvo.

Prepare uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de meio de crescimento completo sem antibióticos em cada poço. Pré-aqueça a placa em incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus. Ligue o sistema de eletroporação. Parâmetros de eletroporação de entrada para células JURKAT ou RAW.

Prepare a mistura célula-DNA para eletroporação. Coletar cultura de células JURKAT em balão de 25 centímetros quadrados. Transfira as células para o tubo de centrífuga de 50 mL. Em seguida, pulverizar as células por centrifugação a 90 x g durante oito minutos à temperatura ambiente.

Quanto aos sobrenadantes, para lavagem, ressuspenda as células com 5 mL de DPBS. Em seguida, gire a suspensão celular por centrifugação, usando a mesma condição da etapa anterior. Remova o DPBS e ressuspenda o pellet celular usando 2 mL de DPBS. Use 10 microlitros de suspensão celular e misture com um volume igual de 0,2% de azul de tripano.

Para estimar a contagem de células, carregue a amostra neste slide de contagem. Insira o slide de contagem no contador de células automatizado e visualize a imagem das células e, em seguida, obtenha um resultado de contagem de células. Calcule 2 milhões de células para 5 repetições de eletroporação, por experimento knock-in.

Transfira o número necessário de células para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Células de pellets por centrifugação. Para economizar tempo, a mistura de eletroporação pode ser preparada durante a etapa de centrifugação. Adicione 2,5 microgramas de cada vetor CRISPR-Cas9, 2,4 microgramas de vetor de direcionamento linearizado e ressuspensão do Buffer R, a um volume total de 55 microlitros, em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL.

Suavemente vórtice e gire brevemente para misturar bem. Deixe a mistura de eletroporação em temperatura ambiente antes de usar. Depois de girar, aspire o DPBS e, em seguida, centrifugue por mais 30 segundos. Remova o máximo de sobrenadante possível. Ressuspenda as células adicionando a mistura de eletroporação preparada. Pipete para cima e para baixo suavemente.

Eletroporação: Quanto à mistura de eletroporação celular, use uma ponta de nucleofecção de 10 microlitros com pipeta.

Importante: Evite bolhas de ar durante a pipetagem, pois isso causará falha na eletroporação. Pressione "Iniciar".

Após a eletroporação, transfira a amostra para um poço de placas de 24 poços com meio de crescimento pré-aquecido. Execute os mesmos procedimentos de eletroporação acima, nas 4 amostras replicadas restantes. Balance suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme das células. Incube as células em uma incubadora de 37 graus por 48 a 72 horas antes da classificação das células FACS.