Edição do genoma CRISPR tudo-em-um: um método para knock-in de gene baseado em reparo dirigido por homologia em células cultivadas usando o sistema CRISPR-Cas9

Comece adicionando plasmídeo CRISPR tudo-em-um às células imunes presentes em um tubo. Este plasmídeo contém um gene Cas9 em combinação com o sgRNA ou sequência codificadora de RNA de guia único, complementar à sequência alvo no genoma do hospedeiro.

Adicione um plasmídeo doador linearizado contendo um transgene imprensado entre braços de homologia ou HAs - as repetições de DNA necessárias para a recombinação homóloga. Realize a eletroporação, que usa corrente elétrica para injetar a mistura de plasmídeos na célula. Uma vez dentro, o sgRNA processado forma um complexo com a nuclease Cas9 expressa.

O sgRNA se liga ao local alvo, permitindo que a nuclease Cas9 identifique a sequência de reconhecimento específica conhecida como motivo adjacente ao protoespaçador ou PAM e clive o DNA do hospedeiro próximo a ele. Isso cria uma quebra de fita dupla sem corte, onde a maquinaria celular resseca o DNA, gerando saliências de 3 '. A presença de locais flanqueadores de HA desencadeia o mecanismo de reparo dirigido por homologia, onde o DNA cortado se junta à sequência HA, formando uma estrutura heteroduplex - a alça D.

A síntese de DNA continua, formando uma fita complementar à sequência trans