Silenciamento de genes baseado em interferência CRISPR: uma técnica para repressão direcionada da função gênica em leptospira patogênica

A interferência CRISPR ou CRISPRi, usa uma variante desativada de Cas9, dCas9, para silenciamento de genes direcionados, que reprime a função do gene.

Para realizar o CRISPRi, use uma construção de vetor shuttle - um plasmídeo contendo origens de replicação correspondentes às bactérias E. coli e Leptospira, facilitando a propagação em ambas as espécies.

O vetor também contém uma sequência específica para o gene dCas9 e um RNA de guia único ou sgRNA, para reconhecer a sequência alvo.

Inicialmente, o vetor shuttle está presente dentro do doador E. coli. Complemente a cultura de E. coli do doador com a Leptospira hospedeira para facilitar a conjugação. A conjugação estabelece contato direto célula a célula entre organismos, facilitando a captação do plasmídeo de transporte por Leptospira. Dentro da célula, a construção do plasmídeo produz sequências de sgRNA e expressa proteínas dCas9.

O sgRNA contém uma região protoespaçadora que reconhece sua região alvo complementar no DNA de Leptospira, próximo ao motivo adjacente ao protoespaçador ou PAM - uma sequência de reconhecimento curta no DNA do hospedeiro. Isso ajuda o dCas9 a formar um complexo com o sgRNA no local alvo a jusante do loc