Silenciamento de genes baseado em interferência CRISPR: uma técnica para repressão direcionada da função gênica em leptospira patogênica

A interferência CRISPR ou CRISPRi, usa uma variante desativada de Cas9, dCas9, para silenciamento de genes direcionados, que reprime a função do gene.

Para realizar o CRISPRi, use uma construção de vetor shuttle - um plasmídeo contendo origens de replicação correspondentes às bactérias E. coli e Leptospira, facilitando a propagação em ambas as espécies.

O vetor também contém uma sequência específica para o gene dCas9 e um RNA de guia único ou sgRNA, para reconhecer a sequência alvo.

Inicialmente, o vetor shuttle está presente dentro do doador E. coli. Complemente a cultura de E. coli do doador com a Leptospira hospedeira para facilitar a conjugação. A conjugação estabelece contato direto célula a célula entre organismos, facilitando a captação do plasmídeo de transporte por Leptospira. Dentro da célula, a construção do plasmídeo produz sequências de sgRNA e expressa proteínas dCas9.

O sgRNA contém uma região protoespaçadora que reconhece sua região alvo complementar no DNA de Leptospira, próximo ao motivo adjacente ao protoespaçador ou PAM - uma sequência de reconhecimento curta no DNA do hospedeiro. Isso ajuda o dCas9 a formar um complexo com o sgRNA no local alvo a jusante do local de início da transcrição do gene.

dCas9 do complexo sgRNA-dCas9 não tem atividade catalítica para clivar fitas de DNA, em vez disso, atua como uma barreira física para o movimento da enzima RNA polimerase formadora de mRNA, eventualmente inibindo a transcrição gênica. Use a Leptospira silenciada por genes para testes adicionais.

Para conjugação, as células de Leptospira são cultivadas a 29 ou 37 graus Celsius em meio HAN. Um dia antes da conjugação, as células de E. coli do doador são cultivadas em meio LB suplementado com ácido diaminopimélico - DAP e espectinomicina.

Em seguida, no dia da conjugação, cultive as culturas saturadas de E. coli em LB mais DAP. Dentro de uma capa de biossegurança, monte o aparelho de filtração colocando o filtro de membrana em cima da base de vidro, seguido de um funil de vidro de 15 mL. Ambas as peças são mantidas juntas pela braçadeira de mola. Em seguida, conecte o vidro a uma bomba de vácuo. Adicione 5 ml de culturas de Leptospira ao funil.

Em seguida, adicione a cepa E. coli β2163 contendo o plasmídeo de interesse. O volume irá variar de acordo com a densidade óptica da cultura. Nosso objetivo é uma proporção de células de 1:1. Gire a bomba de vácuo. Agora, os líquidos passarão pela membrana e as células serão concentradas em cima dela.

Pegue o filtro e coloque-o na placa EMJH mais DAP, com o lado bacteriano para cima. Incube as placas a 29 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, recupere os filtros das placas e coloque-os em um tubo cônico de 50 mL.

Use 1 mL de meio HAN líquido para recuperar as células do filtro por pipetagem. Visualize as células recuperadas por microscopia de campo escuro.

Nesta fase, números equivalentes de E. coli e Leptospiras podem ser vistos. 100 a 200 microlitros são usados para espalhar a bactéria em duas placas HAN contendo espectinomicina. Nesta fase, o DAP é omitido e a E. coli não cresce. As placas são incubadas a 37 graus Celsius e 3% de CO₂. As colônias devem ser aparentes entre 8 a 10 dias.