JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 4:34 min • July 8th, 2025
Para a transfecção reversa de pequenos RNAs interferentes, ou siRNA, uma classe de RNA de fita dupla, em adipócitos ou células de gordura não aderentes, prepare uma suspensão de siRNAs direcionada a um gene codificador de proteína específico em adipócitos. Adicione um reagente de transfecção à base de lipídios catiônicos adequado. Incube a mistura para formar complexos de transfecção por meio de interações eletrostáticas.
Transfira a mistura para poços revestidos de colágeno de uma placa de vários poços. Os complexos de transfecção imobilizam no revestimento da placa por interações não específicas. Pipetar uma suspensão de adipócitos em poços contendo complexos de transfecção imobilizados. Os adipócitos aderem frouxamente ao revestimento da placa, aumentando o contato físico entre as células e os complexos.
O complexo de transfecção se funde à membrana celular e entrega o siRNA ao citoplasma. O siRNA, compreendendo uma fita antisense com uma sequência complementar ao mRNA alvo e uma fita sensorial, é reconhecido pelo complexo silenciador indutor de RNA multiproteico, ou RISC. O siRNA se liga ao RISC e as fitas se separam, com a fita antisense permanecendo ligada ao complexo.
O complexo siRNA-RISC ativado reconhece e se liga aos locais complementares no mRNA alvo. Isso leva à clivagem específica da sequência do mRNA pela proteína argonauta do complexo RISC. O mRNA clivado é ainda mais degradado pela maquinaria celular, silenciando assim a expressão do gene alvo.
Pipete o siRNA com meio essencial mínimo aprimorado para misturar e incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Adicione o reagente de transfecção e o meio essencial mínimo aprimorado ao siRNA e pipete para misturar. Incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a mistura de transfecção a cada poço da placa revestida de colágeno.
Lave as células na placa de Petri de 100 milímetros duas vezes com DPBS. Adicione 5X tripsina às células, certificando-se de cobrir toda a superfície com a tripsina. Aguarde 30 segundos e remova cuidadosamente a tripsina. Incubar a placa de Petri durante 5 a 10 minutos a 37 °C na incubadora.
Em seguida, bata no prato para separar as células, evitando danos às células. Adicione 10 mililitros de DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, 10% de FCS e 1% de penicilina e estreptomicina, para neutralizar a tripsina. Pipetar cuidadosamente o meio para cima e para baixo para separar as células e homogeneizar a suspensão celular.
Conte as células usando uma câmara de contagem de Malassez ou um contador de células automatizado e ajuste a concentração das células para 6,25 x 105 células / mL de meio. Semeie 800 microlitros da suspensão celular por poço de uma placa de 12 poços, ou 400 microlitros da suspensão celular por poço de uma placa de 24 poços contendo a mistura de transfecção.
Incube as placas em uma incubadora de cultura de células e não as perturbe por 24 horas. No dia seguinte, substitua cuidadosamente o sobrenadante por DMEM fresco sem piruvato, glicose 25 mM, FCS 10% e penicilina e estreptomicina 1% e retorne as células à incubadora.