Sistema Regulado Tet-Off Induzível: Um Método In Vitro para Modular a Expressão Gênica em Células Cultivadas Usando o Sistema Tetraciclina-Off

Comece tomando uma suspensão de células receptoras cultivadas em um tubo. Completar o tubo com plasmídeos induzíveis contendo o gene de interesse. A expressão deste gene está sob o controle de uma sequência promotora a montante fundida a um operador de tetraciclina ou TetO, formando um elemento responsivo à tetraciclina ou TRE.

Além disso, adicione vetores reguladores de tetraciclina, cada um contendo um gene que codifica a proteína transativadora de tetraciclina recombinante ou tTA. Eletroporar a mistura célula-DNA para usar pulsos elétricos para facilitar a captação de plasmídeos pela célula.

Após a eletroporação, coloque as células em placas e incube pelo tempo desejado. Ao entrar no núcleo, o vetor de desligamento da tetraciclina expressa a proteína tTA. O tTA é uma proteína híbrida contendo um repressor Tet ou a porção TetR e um domínio transativador de transcrição VP16 viral.

A porção TetR se liga à sequência TetO do elemento TRE, enquanto o domínio VP16 permite que a RNA polimerase sintetize o mRNA a partir do DNA a jusante, levando à expressão gênica. Substitua o meio de crescimento na placa de cultura por meio contendo doxiciclina e incuba.

A doxiciclina - um análogo sinté