Edição de genes mediada por morfolino: uma técnica de knockdown de genes usando oligonucleotídeos morfolinos de bloqueio translacional em ovos de peixes das cavernas unicelulares

Os morfolinos são oligonucleotídeos redesenhados curtos, de fita simples, com diferenças em sua estrutura de fosfato e estrutura de açúcar em comparação com os nucleotídeos naturais. Essas características aumentam a estabilidade dos morfolinos no pH fisiológico. Apesar dessas variações, os morfolinos contêm as nucleobases padrão, que ajudam no design de oligonucleotídeos complementares à sequência específica de mRNA de um gene alvo desejado a ser derrubado.

Para realizar a edição de genes orientada por morfolino, comece pegando ovos unicelulares de peixes das cavernas colocados dentro dos poços de uma placa de injeção de agarose. Visualize os ovos translúcidos e redondos para localizar o saco vitelino - uma estrutura cheia de líquido presente dentro do ovo.

Pegue uma agulha de microinjeção pré-cheia com uma solução contendo morfolinos projetados. Injete a solução diretamente na gema do ovo, garantindo que os morfolinos entrem no citoplasma da célula. Dentro das células, o gene alvo forma o mRNA, que é transportado para o citoplasma.

Dentro do citoplasma, o morfolino injetado hibridiza com seu transcrito de mRNA alvo complementar no local de iniciação endógeno e se estende além dele. Este processo bloqueia a ligação da subunidade maior do ribossomo com o complexo de iniciação da tradução nascente que consiste em uma pequena subunidade ribossômica complexada com algumas proteínas específicas.

Posteriormente, a progressão do complexo de iniciação da tradução é dificultada estericamente, o que interrompe a tradução do mRNA para a proteína. Finalmente, a concentração da proteína alvo diminui devido ao bloqueio translacional por morfolinos.

No dia da injeção, use uma pipeta de vidro para transferir óvulos unicelulares para a placa de injeção, enchendo até cinco fileiras da placa de injeção com 30 a 40 ovos por fileira. Mantenha os ovos hidratados com uma pequena quantidade de água do sistema de peixes. Descongele o morfolino no gelo e prepare a solução injetável de modo que 400 picogramas de morfolino sejam injetados por ovo, usando uma ponta de pipeta Microloader longa ou adicionando um bolus de 2 a 4 microlitros até o final.

Quando todas as agulhas estiverem carregadas, use uma pinça para aparar o excesso de comprimento das pontas das agulhas de injeção e monte a primeira agulha em um micromanipulador conectado a um microinjetor de picolitros. Em seguida, coloque o prato de injeção sob um microscópio de dissecação e use o micromanipulador para penetrar em cada ovo com a agulha, antes de injetar 1 nanolitro de solução de injeção de morfolino diretamente na gema.