JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 5:40 min • July 8th, 2025
Comece com embriões de peixe-zebra viáveis em estágio de uma célula colocados nos poços de um molde de microinjeção.
Carregar uma agulha de microinjecção com uma solução contendo ARNm codificador de transposase Tol2 e plasmídeos dadores de transposões. Os plasmídeos compreendem um promotor onipresente de peixe-zebra e um gene codificador de proteína fluorescente flanqueado por braços de transposon Tol2.
Injete cuidadosamente a solução de microinjeção no citoplasma do embrião de peixe-zebra. Dentro da célula, os mRNAs da transposase Tol2 se traduzem em proteínas transposase Tol2 e são ativamente transportados para o núcleo.
Os locais Tol2 no plasmídeo doador compreendem repetições terminais invertidas específicas, ou ITRs, flanqueando o gene repórter. Os ITRs são flanqueados por repetições curtas e diretas. As proteínas transposase reconhecem e se ligam aos sítios ITR, formando um grampo no DNA flanqueador. As transposases clivam ainda mais a construção do transposon do DNA flanqueador, liberando-o do plasmídeo e deixando para trás repetições curtas e diretas.
As transposases criam uma quebra de fita dupla escalonada no genoma da célula somática e inserem a construção do transposon no sítio do genoma. O preenchimento da lacuna das extremidades escalonadas pela DNA polimerase seguido pela ligação dos cortes cria repetições curtas e diretas.
A ligação causa integração estável da construção do transposon no genoma da célula somática e o promotor facilita a expressão da proteína fluorescente. Incube os embriões injetados. Durante o desenvolvimento embrionário, as células somáticas dão origem a diferentes tipos de células e criam peixes-zebra transgênicos.
Depois de preparar o mRNA da transposase Tol2 e a solução de injeção, de acordo com o protocolo de texto, na tarde anterior à injeção, montou de quatro a seis tanques de reprodução com pelo menos dois machos e duas fêmeas. Para reduzir a quantidade de resíduos de peixes e induzir uma resposta reprodutiva, evite alimentar os peixes à tarde.
Na manhã seguinte, remova a solução de injeção preparada do freezer negativo de 80 graus Celsius e coloque-a no gelo. Puxe as divisórias nos tanques de criação de peixes e deixe os peixes acasalarem. Em geral, os peixes põem ovos em 20 a 30 minutos.
Enquanto espera, usando um extrator de micropipeta com os seguintes parâmetros, puxe as agulhas do vidro capilar. Use um lenço de laboratório para quebrar a ponta da agulha e criar uma borda chanfrada. Um diâmetro menor é preferido para diminuir a mortalidade embrionária.
Depois que os peixes botarem ovos, colete-os em uma placa de Petri de 10 centímetros de diâmetro. Imediatamente sob o microscópio de dissecação, remova todos os embriões anormais e resíduos de peixes. Em seguida, pipete os embriões fertilizados em um molde de injeção de agarose a 3% preparado. Remova o excesso de água para ajudar a manter os embriões no lugar.
Uma vez que todas as fileiras estejam cheias de embriões viáveis, organize-as de forma que as células individuais sejam orientadas em um ângulo de 45 graus horizontalmente em relação à agulha. Isso tornará a injeção muito mais fácil mais tarde. Em seguida, usando luvas, use uma ponta de pipeta de carregamento de 20 microlitros para remover 5 microlitros da construção preparada do tubo no gelo.
Insira cuidadosamente a ponta da pipeta na extremidade traseira do tubo capilar quebrado até onde ele começa a afinar, para que o reagente fique o mais próximo possível da ponta e expulse-o para o capilar. Se ainda houver bolhas de ar, agite a agulha, tomando cuidado para não quebrar a ponta.
Insira a agulha diretamente no porta-agulha de microinjeção e aperte cuidadosamente até que a agulha permaneça no lugar e, em seguida, ajuste o ângulo para cerca de 45 graus. Depois que a agulha estiver preparada e conectada, ligue o microscópio e o tanque de pressão de gás. Ajuste o volume de injeção usando aproximadamente 0.5 PSI para segurar e 30 PSI para ejeção.
Verifique se a solução é ejetada da agulha ao pressionar o pedal. Usando um micrômetro de estágio com uma gota de óleo mineral, ajuste o volume e o fluxo da solução para aproximadamente 10 micrômetros de diâmetro. Certifique-se de que a contrapressão permita que uma pequena quantidade de solução escorra da agulha.
Se não houver contrapressão suficiente, a ação capilar fará com que o líquido entre na agulha e destrua o mRNA. Uma vez que a agulha esteja calibrada, insira a agulha na única célula dos embriões fertilizados usando a borda do entalhe de gel para fornecer um suporte que mantenha o embrião no lugar e permita que a agulha aplique pressão sem mover o embrião.
Assim que a ponta da agulha estiver na célula única, pressione o pedal para liberar a quantidade desejada de solução. É importante injetar a solução na célula, não a gema para gerar peixe-zebra transgênico. Repita esse processo para todos os embriões.
Quando terminar, use uma pipeta de transferência descartável de 3,4 mililitros e água do sistema de peixes para transferir os embriões injetados para um prato rotulado, enxaguando-os do entalhe de agarose. Armazene os embriões em uma incubadora de 28,5 graus Celsius para deixá-los se desenvolver.