Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:29 min. • July 8th, 2025
Comece com uma suspensão de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, hiPSCs, em tampão de eletroporação adequado. Adicionar uma solução constituída por plasmídeos codificadores de transposase PiggyBac e plasmídeos doadores. Eletroporar a mistura.
Os pulsos elétricos permeabilizam transitoriamente as membranas celulares, facilitando a captação celular de plasmídeos. Os plasmídeos doadores compreendem repetições terminais invertidas específicas do transposon, ITRs, que são complementos invertidos uns dos outros, flanqueados por repetições TTAA que colocam entre parênteses a proteína alvo e genes de resistência a antibióticos.
As proteínas de transposase PiggyBac expressas criam cortes nas extremidades 3 'dos ITRs, internos às repetições TTAA. Os grupos 3'-hidroxila expostos atacam o nucleotídeo da fita complementar dentro do DNA flanqueador, formando grampos de cabelo TTAA nas extremidades do transposon, liberando assim a construção do transposon do plasmídeo.
As transposases resolvem os grampos de cabelo para formar saliências de TTAA nas extremidades 5 'da construção do transposon. As transposases criam ainda quebras de fita dupla na sequência TTAA no genoma do hospedeiro. As extremidades do transposon 3'-hidroxila liberadas atacam a sequência TTAA nas extremidades escalonadas, resultando na união covalente da construção do transposon ao genoma do hospedeiro, deixando lacunas de fita simples flanqueando a construção do transposon. Essas lacunas no DNA do hospedeiro são ligadas, levando à integração estável da construção do transposon.
Trate os hiPSCs semeados em uma placa revestida de proteína de matriz extracelular com meio contendo antibióticos. O gene de resistência a antibióticos, impulsionado pelo promotor a montante, permite a seleção de células editadas por genes.
Enxágue a cultura de iPSC humana com PBS livre de cálcio e magnésio, antes de tratar as células com reagente de dissociação celular por 5 a 10 minutos a 37 graus Celsius. Quando as células começarem a se desprender do recipiente de cultura, use uma pipeta P1000 para dissociar manualmente as células 3 a 4 vezes.
Transfira as células para um tubo de 15 mililitros e aumente o volume final para 10 mililitros com PBS fresco sem cálcio e magnésio, para contagem. Colete 1 x 106 células por centrifugação e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão R do kit de eletroporação.
Adicione 4,5 microgramas de DNA de plasmídeo vetorial transponível e 0,5 microgramas do DNA do plasmídeo de transposase PiggyBac para transfecção. Transfecção com o sistema de eletroporação celular de acordo com as instruções do fabricante, com os parâmetros indicados. Então. semear as células em meio iPSC humano suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolares Y-27632 em um prato revestido com matriz de 6 milímetros.