Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:12 min. • July 8th, 2025
Para microinjetar DNA exógeno no embrião de Anopheles, pegue o número desejado de ovos de mosquito pré-blastoderma recém-colhidos. Nesse estágio inicial de desenvolvimento, o óvulo contém núcleos sem formar estruturas celulares.
Coloque os ovos em forma de barco na periferia de um mata-borrão úmido presente na superfície de uma lâmina de vidro. Esta etapa garante a hidratação adequada do embrião para facilitar a injeção nas etapas subsequentes. Alinhe os ovos adjacentes uns aos outros com a superfície ventral exposta para fora.
Agora, pegue uma agulha de microinjeção de calibre estreito contendo a solução de plasmídeo desejada. Use um microscópio de dissecação para posicionar a agulha perto do pólo posterior do ovo - um local para os precursores das células germinativas. Insira a agulha em um ângulo apropriado que perfure o exocório - a camada externa - e o endocório - uma camada interna da casca do ovo - eventualmente atingindo o embrião.
Injete a mistura de plasmídeo na gema do embrião. Retraia suavemente a agulha e deixe os ovos crescerem em condições adequadas. À medida que o óvulo cresce, alguns núcleos migram para o pólo posterior, onde podem incorporar o DNA microinjetado. Esses núcleos mais tarde se tornam gametas - as células sexuais que podem resultar em mutações germinativas hereditárias.
Visualize os mosquitos adultos para fenótipo transformado - as características observáveis nas gerações subsequentes confirmando a microinjeção bem-sucedida.
Use uma ponta de microcarregador para encher as agulhas com dois microlitros de mistura de DNA. Insira a agulha no porta-agulha e conecte a tubulação da bomba de pressão automatizada. Alinhe a agulha de forma que ela faça um ângulo de 15 graus com o plano do slide.
Abra a ponta da agulha tocando cuidadosamente no primeiro ovo. Em seguida, insira a ponta da agulha a cerca de 10 micrômetros no pólo posterior. Uma injeção bem-sucedida levará a um pequeno movimento do citoplasma dentro do óvulo.
Use os controles de estágio coaxial do microscópio para passar para o próximo ovo para continuar a injeção. Para garantir que a ponta da agulha permaneça aberta e não esteja entupida, pressione o botão 'Injetar' antes de inserir outro embrião e visualize a pequena gota na abertura da agulha. Se a agulha ficar entupida, pressione o botão 'Limpar' para limpar a agulha e repita o teste de visualização de gotículas.
Ajuste a pressão conforme necessário, se a abertura da ponta da agulha ficar um pouco maior para garantir que o tamanho da gota permaneça pequeno. Injete cerca de 40 a 50 ovos com uma agulha. Após a conclusão das injeções, enxágue os ovos em um recipiente de vidro forrado com papel de filtro e cheio com 50 mililitros de água deionizada.