Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:48 min. • July 8th, 2025
Para realizar a transferência hidrodinâmica do gene, comece pegando uma seringa cheia de uma solução salina contendo plasmídeos recombinantes que carregam o gene de interesse. Posteriormente, pegue um modelo de camundongo e injete rapidamente um grande volume de solução de plasmídeo na base da cauda, garantindo que a solução de plasmídeo seja injetada por via intravenosa na veia da cauda.
A injeção pressurizada de um alto volume de plasmídeos gera uma força mecânica chamada força hidrodinâmica, que aumenta a pressão intravascular na veia cava inferior - uma veia que transporta sangue desoxigenado para o coração.
Grande volume de líquido induz congestão no ventrículo direito do coração, forçando a reversão na direção do sangue. Esta etapa força a solução plasmidial a entrar na veia hepática, que a transporta para o fígado.
Os plasmídeos se movem dentro dos sinusóides hepáticos - os espaços no fígado revestidos pelas células endoteliais. O aumento do volume sanguíneo ajuda os plasmídeos a permeabilizar a camada endotelial, ajudando-os a chegar perto dos hepatócitos circundantes - as células do fígado.
O rápido influxo de solução de plasmídeo induz pressão na membrana celular do hepatócito, gerando poros transitórios. Esses poros facilitam a captação do DNA do plasmídeo pelas células. Mais tarde, os poros da membrana se fecham, prendendo os plasmídeos dentro dos hepatócitos.
A expressão bem-sucedida do gene de interesse nos hepatócitos confirma a transfecção.
Comece pesando os camundongos e, em seguida, prepare uma solução salina estéril contendo 15 microgramas por mililitro de construção de vetor de beleza adormecida sem endotoxina salina e 1 micrograma por mililitro de pc-HSB5 livre de endotoxina. Prepare solução suficiente para injetar em cada camundongo um volume de 10% do peso corporal. Encha uma seringa estéril de 3 mililitros com o volume necessário para um camundongo e coloque uma agulha de calibre 27.
Depois de adicionar uma quantidade adequada de papel de seda para deixar espaço mínimo para movimento, mas espaço suficiente para respirar, insira o mouse em um limitador apropriado com orifícios de respiração. Aqueça a cauda usando uma lâmpada infravermelha por 30 a 60 segundos, enquanto observa cuidadosamente os sinais de superaquecimento, como movimento rápido da cauda ou outros sinais de agitação, em seguida, limpe a cauda com um cotonete embebido em álcool.
Insira a agulha quase horizontalmente em uma das duas veias laterais da cauda próximas à base da cauda. Se colocado com sucesso, uma pequena quantidade de sangue pode fluir de volta para o cone da agulha. Injete o volume total na veia da cauda dentro de 8 a 10 segundos. Após a injeção, remova imediatamente o mouse do limitador. Comprima a ferida injetável com gaze estéril por pelo menos 30 segundos ou até que o sangramento desapareça.
A injeção hidrodinâmica bem-sucedida da veia da cauda é crucial para a transfecção e, especialmente, depende da velocidade, volume e tempo de injeção. Para facilitar a injeção intravenosa, certifique-se de que os camundongos não estejam estressados ou desidratados no dia da injeção.
Após 30 a 60 minutos de alojamento solo em uma gaiola de recuperação, transfira o mouse de volta para sua gaiola original.