Entrega de genes in vitro mediada por eletroporação: uma técnica de pulso elétrico para introduzir plasmídeos codificadores de proteínas repórter fluorescentes em células cultivadas

Para entrega de DNA de plasmídeo baseado em eletroporação em células neuronais primárias, comece com uma suspensão de células em meios de eletroporação adequados. Adicione DNA de plasmídeo codificador de proteína fluorescente para preparar a mistura de eletroporação.

Transfira suavemente a mistura de eletroporação para uma cubeta de eletroporação, evitando bolhas de ar que possam afetar negativamente a eficiência da eletroporação. Transfira a cubeta para o suporte da cubeta do eletroporador; Defina os parâmetros de eletroporação. Inicie a eletroporação.

Os pulsos elétricos curtos de alta tensão aplicados através da membrana celular causam acúmulo de carga diferencial em ambos os lados da membrana, aumentando o potencial transmembrana, a voltagem através da membrana celular.

Quando o potencial transmembrana induzido excede o potencial de quebra da bicamada lipídica, a bicamada lipídica se desestabiliza com a mudança de configuração localizada, formando poros hidrofílicos transitórios na membrana celular. Os poros com tamanho adequado fornecem um caminho para o DNA do plasmídeo entrar no citoplasma da célula.

Após a conclusão da eletroporação, a bicamada lipídica é selada novamente, restaurando a integridade da bicamada da membrana celular, aprisionando assim o DNA do plasmídeo. Além disso, durante a fase do ciclo celular em que a membrana nuclear, a membrana de camada dupla que envolve o núcleo, se desmonta, o DNA do plasmídeo se transloca para o núcleo.

Colocar células eletroporadas em poços contendo meio de uma placa de vários poços com lamínulas revestidas de proteínas. Incube para permitir que as células adiram à lamínula revestida de proteína. Células transfectadas com sucesso contendo DNA de plasmídeo expressam as proteínas fluorescentes.

Para começar, adicione 0,5 mililitros de meio de cultura em cada parede da placa de cultura de 24 poços contendo lamínulas revestidas e mantenha-a aquecida a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Pipete o número necessário de células para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro e gire a 200 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de Opti-MEM. Repita este procedimento duas vezes para garantir que nenhum meio de cultura residual esteja presente no tubo. Defina os parâmetros de eletroporação conforme listado. Pipete a reação de eletroporação suavemente para misturar bem e use uma ponta de pipeta P200 longa para transferir um volume exato de 100 microlitros da mistura para a cubeta de dois milímetros.

Quando a cubeta estiver dentro da câmara da cubeta, pressione o botão ômega do eletroporador e observe o valor da impedância aderindo a um volume preciso de 100 microlitros. A faixa de valores de impedância deve ser de aproximadamente 30 e 35.

Pressione o botão Iniciar para iniciar o pulso. Registre os valores atuais medidos e as joias mostradas no quadro de leitura. Remova a cubeta da câmara.

Adicione imediatamente 100 microlitros de meio de cultura pré-aquecido na cubeta e ressuspenda-o pipetando para cima e para baixo duas a três vezes. Transfira imediatamente a suspensão da célula para a placa de 24 poços previamente preparada. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono.