Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:31 min. • July 8th, 2025
A entrega de genes lentivirais assistida por laser é uma técnica para transferir um transgene para um sistema hospedeiro.
Para produzir camundongos transgênicos, comece com ovos fertilizados de camundongos isolados em um meio de cultura adequado. Coloque a placa de cultura contendo óvulo fertilizado em um microscópio pré-instalado com um aparelho de laser e conectado a um software de controle. Observe com ampliação adequada.
Os ovos fertilizados são cercados por zona pelúcida, uma camada protetora de glicoproteína que bloqueia as partículas lentivirais. Para permear essa barreira, ligue o aparelho de laser e certifique-se de que o LED do laser esteja visível sobre a zona pelúcida. Usando o software de controle, dispare o laser. Ajuste a duração do disparo de acordo com o diâmetro de perfuração desejado.
Coloque os ovos em uma incubadora para recuperação. Após uma breve incubação, remova os ovos e adicione partículas de lentivírus carregando o gene de interesse e um marcador selecionável fluorescente.
Com a zona pelúcida perfurada, o lentivírus se difunde facilmente em direção à membrana do óvulo e entra por endocitose. O lentivírus se desmonta, liberando seu RNA, que, quando processado sequencialmente em um DNA de fita dupla, entra no núcleo do hospedeiro, integrando os genes estranhos ao genoma do hospedeiro.
Incube os ovos e permita que eles se desenvolvam em blastocistos. Implante os blastocistos em camundongos fêmeas acasalados. Quando a gestação estiver completa, recupere os filhotes e analise-os quanto à presença de transgenes.
Enquanto os ovos estiverem na incubadora, configure e calibre o laser XYClone de acordo com as recomendações do fabricante. Quando os ovos estiverem prontos, coloque a primeira placa de gota no estágio do microscópio a laser e focalize manualmente a zona pelúcida. Depois de confirmar que a luz LED do laser é visível através da objetiva, mova a platina do microscópio para atingir a zona com o laser LED e use o software do computador para definir o laser XYClone para 250 microssegundos.
Ajuste o tamanho da luz LED para as dimensões apropriadas e perfure a zona pelúcida de cada ovo três vezes com o laser para produzir três orifícios de 10 micrômetros.
É fundamental realizar a perfuração de forma rápida, mas cuidadosa, pois os ovos fertilizados não podem ficar fora da incubadora por mais de 15 minutos.
Em seguida, retorne os ovos perfurados à incubadora por mais duas horas. No final da segunda incubação, trate a gota de KSOM de 50 microlitros com 2 microlitros de lentivírus concentrado sem misturar e devolva os ovos à incubadora por quatro dias. Quando os ovos se desenvolverem em blastocistos, use um dispositivo de transferência de embriões não cirúrgico para depositar aproximadamente 10 a 15 embriões e cerca de 2 microlitros de KSOM.
17 dias após a transferência do embrião, permita que a rata grávida dê à luz naturalmente ou recolha os recém-nascidos por cesariana, conforme necessário.