Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 5:33 min. • July 8th, 2025
Comece com um volume ideal de esferas de ouro - veículos de entrega de genes biologicamente inertes e não tóxicos - em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, adicione agentes catiônicos - espermidina e cloreto de cálcio, seguidos pelos fragmentos de DNA desejados às contas de ouro. Agite suavemente o tubo e incuba.
O cloreto de cálcio se liga aos fragmentos de DNA e facilita seu revestimento sobre as contas de ouro por meio de resíduos de espermidina. Em seguida, centrifugue e remova o solvente. Ressuspenda as esferas revestidas de DNA em etanol. Pipetar suavemente os grânulos num disco macrotransportador estéril. Deixe secar.
Configure um aparelho de arma de genes biolísticos compreendendo um tubo de aceleração de gás hélio e uma câmara de bombardeio com um disco de ruptura e uma tela de parada em seus respectivos slots. Em seguida, inverta o disco macroportador e carregue-o abaixo do disco de ruptura.
Em seguida, coloque as células-alvo hospedeiras cultivadas em um meio sólido adequado suplementado com sorbitol - um estabilizador osmótico para melhorar a eficiência da transformação. Quando a configuração estiver pronta, dispare a arma genética.
À medida que o hélio desce pelo tubo de aceleração, a pressão continua a aumentar até que o disco de ruptura se quebre, criando ondas de choque de hélio. Essas ondas de choque impulsionam o disco macroportador que carrega contas de ouro em direção à tela de parada, o que permite que apenas as contas de ouro passem.
As esferas de ouro aceleradas penetram no núcleo da célula hospedeira, integrando o DNA desejado ao genoma da célula hospedeira.
Comece usando uma pinça para submergir discos biolísticos macrotransportadores laranja em 100% de etanol e, em seguida, transfira os discos para uma grande placa de Petri contendo drierita, tomando cuidado para que os discos não toquem no dessecante. Depois de secos, pressione os discos em suportes de disco de prata limpos com etanol e, em seguida, vortex um tubo de contas de ouro e alíquota de 12 microlitros da solução de esferas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro por transformação.
Em seguida, adicione sequencialmente 2 microgramas de DNA, 10 microlitros de cloreto de cálcio e dois microlitros de base livre de espermidina em cada tubo de contas. Em seguida, vórtice cada amostra, incube os tubos à temperatura ambiente por 5 minutos, com movimentos suaves ocasionais para ressuspender as esferas sedimentadas.
No final da incubação, jogue as contas de ouro revestidas de DNA e aspire cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda lentamente os grânulos completamente em 600 microlitros de etanol 100% e, em seguida, prenda as células novamente, desta vez ressuspendendo os grânulos em 8 microlitros de etanol.
Agora dispense cada tubo de contas no centro de um disco biolístico individual em círculos de 1 centímetro de diâmetro. Se houver uma concentração suficiente de contas, um círculo dourado será visível no centro de cada disco quando as contas estiverem secas.
Para operar a pistola genética, primeiro ligue a bomba de vácuo e, em seguida, gire o botão do tanque de hélio no sentido anti-horário até que uma pressão de aproximadamente 2200 PSI seja atingida no manômetro. Em seguida, gire o botão vermelho esquerdo para ligar a pistola genética e ajuste as taxas de fluxo para o vácuo e a ventilação para que o vácuo atinja 28 polegadas de mercúrio em 15 segundos. Confirme se a distância entre o disco de ruptura e o macroportador também é de aproximadamente 3/8 de polegada neste momento.
Quando tudo estiver em posição, limpe toda a câmara com etanol a 70% e mergulhe os discos de ruptura em etanol a 100%. Depois de secar os discos em uma superfície estéril, use uma chave de torque para soltar o suporte do disco de ruptura e insira um disco limpo. Aparafuse o suporte do disco de ruptura de volta no lugar e gire-o uma vez para a direita com a chave de torque para apertá-lo.
Em seguida, mergulhe as telas em etanol 100%. Depois de seco, coloque uma tela na placa de montagem de plástico branco e coloque o suporte do disco macrocarrier, com o lado do DNA voltado para baixo, na câmara do disco. Aparafuse a tampa prateada e coloque a placa de montagem no slot mais alto e, em seguida, coloque uma placa de ágar YPD contendo 1 molar de sorbitol na placa inferior.
Agora feche a porta da câmara e trave-a no lugar, em seguida, empurre e segure o interruptor vermelho do meio na posição para cima para engatar o vácuo e permitir que ele atinja 28 polegadas de mercúrio. Assim que o nível de vácuo adequado for atingido e o interruptor do meio tiver sido movido para a posição para baixo, mantenha pressionado o botão vermelho direito para disparar.
Quando o disco de ruptura estourar, solte imediatamente o botão de disparo e empurre o interruptor vermelho do meio para a posição central para ventilar a câmara a 0 PSI. Se o tiro for bem-sucedido, um anel de ouro ficará visível na placa. Limpe o disco de ruptura e os detritos do disco macrotransportador e desligue a pistola genética e, em seguida, gire o botão do tanque de hélio no sentido horário para desligar o gás e desligar a bomba de vácuo.