JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 3:02 min • July 8th, 2025
Para transduzir células hospedeiras com RNA contendo vetores retrovirais, pegue um tubo contendo vetores empacotados em meios adequados. Cada vetor contém um capsídeo viral, contendo o complemento de RNA do transgene a ser integrado ao genoma do hospedeiro e enzimas virais importantes. Uma bicamada lipídica envolve o capsídeo para facilitar a entrada na célula hospedeira.
Adicionar os vectores na presença de um reagente de transfecção adequado ao poço de uma placa de cultura contendo a suspensão da célula hospedeira. Cubra o prato. Centrifugue em baixa velocidade para permitir a transdução de spin. Isso aproxima o vetor viral da superfície da célula hospedeira, aumentando a eficiência da transdução.
Simultaneamente, os policátions no reagente de transfecção neutralizam cargas negativas no vírus e na célula hospedeira, promovendo a adsorção viral nas células-alvo.
Consequentemente, os receptores na superfície do vírus facilitam sua fusão com a membrana do hospedeiro. O capsídeo viral entra na célula e se rompe, liberando RNA transgênico e enzimas virais em seu citoplasma.
Dentro do citoplasma, a transcriptase reversa viral converte o RNA em um DNA complementar de fita simples, posteriormente transformando-o em DNA proviral de fita dupla. O DNA resultante entra no núcleo. A enzima integrase viral medeia a integração do DNA proviral no genoma do hospedeiro, resultando em células transduzidas.
Colete sobrenadante viral fresco da linhagem celular produtora viral. Neste ponto, as células devem estar bem espaçadas com uma morfologia definida. Em seguida, aspire cuidadosamente os 2 mililitros superiores de meio de cada poço da placa de 6 poços contendo as células da medula óssea. Evite aspirar as células da medula óssea que geralmente estão concentradas no meio do poço.
Adicione 3 mililitros de sobrenadante viral recém-suplementado a cada poço da placa de 6 poços contendo células da medula óssea. Depois de embrulhar as placas em plástico, repita a transdução de spin e, em seguida, coloque as placas desembrulhadas na incubadora de cultura de tecidos. Após 24 horas no terceiro dia, remova e substitua 2 mililitros de mídia dos poços.