Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 2:59 min. • July 8th, 2025
Para a separação por cromatografia de troca aniônica de uma proteína de interesse de um lisado de proteína bacteriana dialisada, adicione um tampão de ligação para reduzir a viscosidade do lisado e evitar que ele obstrua a coluna cromatográfica.
Os agentes quelantes no tampão se ligam a cátions divalentes, inibindo a atividade da protease e impedindo a degradação da proteína. Além disso, o tampão com pH acima do ponto isoelétrico da proteína-alvo, pI, o pH no qual a proteína não tem carga líquida, faz com que o excesso de íons hidroxila carregados negativamente neutralize os grupos amina carregados positivamente da proteína, tornando a superfície da proteína carregada negativamente.
Montar a coluna de cromatografia de permuta aniónica contendo a fase estacionária reticulada à base de agarose com grupos aminas quaternárias carregadas positivamente. Adicione o tampão de ligação para preparar a coluna para interação máxima de proteínas durante o carregamento da amostra. Carregue o lisado bacteriano diluído.
As proteínas-alvo carregadas negativamente ligam-se mais fortemente aos grupos carregados positivamente na coluna do que as proteínas menos carregadas negativamente.
Execute o tampão de ligação para remover proteínas carregadas positivamente não ligadas da coluna. Passe um tampão de eluição pela coluna, aumentando gradualmente a concentração de sal. Em baixas concentrações de sal, os íons negativos competem com proteínas fracamente ligadas para se ligar à coluna, causando sua eluição.
Posteriormente, o tampão de alta concentração de sal desloca proteínas de interesse fortemente ligadas com um tempo de retenção mais longo, eluindo as proteínas-alvo. As proteínas-alvo coletadas podem ser usadas para análises posteriores.
Inicie o FPLC com a manutenção geral. Conecte os buffers de coluna AIEX-A e AIEX-B às válvulas tampão e a coluna contendo resina de troca aniônica às portas de coluna do FPLC. Ajustar os parâmetros cromatográficos gerais em conformidade.
Inicie o programa AIEX no software FPLC e escolha o volume de equilíbrio para o buffer A. Em seguida, carregue a amostra na coluna e elua as proteínas com um gradiente linear de 0% a 100% de tampão com alto teor de sal. Colete frações de 2 mililitros durante a eluição.
Analise as frações eluídas após terminar a corrida.