Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:22 min. • July 8th, 2025
A cromatografia de interação hidrofóbica dependente de cálcio é uma técnica para separar proteínas de ligação ao cálcio de outras proteínas não ligantes de cálcio em uma amostra.
Para começar, pegue uma coluna de cromatografia pré-montada contendo uma matriz de grânulos de agarose reticulados derivatizados com grupos fenil hidrofóbicos para facilitar as interações com as proteínas-alvo. Equilibre-o com um tampão de ligação contendo uma concentração muito alta de íons de cálcio para interação máxima de resina e proteína-alvo durante o carregamento subsequente da amostra.
Pegue uma amostra contendo a mistura de proteínas dialisada e complemente-a com uma concentração igual de cloreto de cálcio usada no tampão de ligação para equilíbrio da coluna. Isso maximiza a ligação de proteínas à coluna.
Os íons de cálcio se ligam a proteínas específicas no lisado, induzindo uma mudança conformacional nessas moléculas de proteína, expondo suas regiões hidrofóbicas.
Filtre a mistura para separar impurezas e agregados para evitar que entupam a coluna. Carregar este filtrado na coluna pré-equilibrada. Proteínas com regiões hidrofóbicas expostas interagem com os grupos fenil hidrofóbicos correspondentes da resina.
Lave usando o tampão de ligação contendo sal para remover proteínas não ligadas para aumentar a pureza da amostra em etapas posteriores. Passe o tampão de eluição sem cloreto de cálcio contendo EDTA - um quelante divalente - através da coluna.
À medida que o EDTA quelata os íons de cálcio, as interações hidrofóbicas entre a proteína alvo e a resina são interrompidas. As proteínas-alvo tornam-se móveis e eluem da coluna.
Para continuar a purificação da proteína, após a diálise da proteína, adicione cloreto de cálcio à amostra até uma concentração final de 25 milimolares, o que facilitará a ligação do S100A12 à resina na próxima etapa. Em seguida, filtre a amostra através de um filtro com um tamanho de vazamento de 0,45 mícrons.
Equilibre tampões HIC e amostras a 4 graus Celsius. Em seguida, conecte os buffers de coluna HIC-A e B e a coluna ao sistema e ajuste os parâmetros.
Inicie o método para equilibrar a coluna com 1 a 2 volumes de coluna de tampão HIC-A e carregue a amostra e o 'bloco de amostra não ligado de lavagem' quando o sinal UV atingir o nível de linha de base novamente.
Em seguida, inicie a eluição com um tampão de cálcio contendo EDTA. Colete 2 mililitros de frações de pico durante a eluição.