Purificação de proteínas baseada em cromatografia de afinidade de níquel: uma técnica para purificar proteínas recombinantes marcadas com poli-histidina a partir de lisado de células bacterianas

Para purificar a proteína recombinante fundida à etiqueta de poli-histidina - uma sequência de resíduos de histidina em um terminal - de um lisado de células bacterianas, primeiro dilua o lisado celular para evitar o entupimento da coluna durante a execução cromatográfica.

Montar uma coluna de afinidade contendo catiões divalentes de níquel imobilizados sobre uma matriz de grânulos de agarose utilizando ácido nitrilotriacético, um agente quelante. O ácido nitrilotriacético se liga aos cátions de níquel por meio de quatro sítios covalentes coordenados, enquanto dois locais no íon metálico permanecem disponíveis para interações com marcadores de poli-histidina na proteína de interesse.

Equilibre a coluna com tampão adequado para otimizar as condições para interações metal-proteína eficazes. Carregue o lisado celular na coluna.

As proteínas recombinantes, transportando resíduos de histidina terminal acessíveis, formam ligações de coordenação com cátions de níquel devido à alta afinidade do íon metálico pelo imidazol, a cadeia lateral da histidina, e se ligam à matriz. O alto número de histidinas consecutivas na proteína recombinante fortalece sua ligação à matriz.

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