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A parede celular micobacteriana contém diferentes variantes de ácidos micólicos - ácidos graxos de cadeia longa com cadeias alfa conservadas. Existem diferenças estruturais em suas cadeias beta, resultando em variações na polaridade de diferentes ácidos micólicos.
Para separar as variantes usando cromatografia em camada fina, ou TLC - uma técnica de cromatografia líquida - pegue lipídios da parede celular micobacteriana no solvente orgânico desejado. Localize os lipídios perto da base de uma placa TLC pré-revestida com uma fina camada de material adsorvente, que funciona como a fase estacionária.
Coloque a placa dentro de um frasco contendo um solvente orgânico - a fase móvel - certificando-se de que o nível do líquido esteja abaixo dos pontos de amostra para evitar a difusão prematura dos ácidos micólicos.
Durante a execução, a fase móvel sobe através dos minúsculos poros da camada adsorvente na placa por ação capilar. Eventualmente, os ácidos micólicos se dissolvem no solvente e viajam para cima.
Variantes mais polares do ácido micólico são transitoriamente adsorvidas pela fase estacionária polar por meio de forças intermoleculares, dificultando seu movimento ascendente. Menos ácidos micólicos polares permanecem na fase móvel não polar e migram ainda mais.
As diferenças na migração resultam na separação das variantes do ácido micólico em bandas discretas.
Após a conclusão, borrife a placa seca com uma mancha de ácido fosfomolíbdico. Aqueça a placa para reduzir a mancha na presença dos lipídios, conferindo uma cor verde escura às bandas.
Para analisar as amostras por TLC, cubra uma parede da câmara TLC com um pedaço de papel de filtro. Adicione vaselina nos cantos da câmara para selar a câmara. Transvase a mistura de solventes sobre o papel de filtro e adicione o volume restante do solvente ao fundo da câmara de TLC. Feche a câmara TLC por pelo menos 20 minutos para saturá-la
Enquanto isso, dissolva os lipídios no tubo de vidro em 200 a 1.000 microlitros de clorofórmio e use um tubo de vidro capilar para aplicar 10 microlitros da suspensão lipídica-clorofórmio diretamente na placa TLC. Depois de deixar a amostra secar por cinco minutos, insira a placa na câmara saturada de TLC e deixe a fase móvel passar pelo TLC.
Quando o solvente atingir 1 centímetro da extremidade superior da placa, coloque a placa sob fluxo laminar até que a sílica esteja completamente seca. Em seguida, borrife a placa seca com 15 a 20 mililitros de hidrato de ácido molibdatofosfórico a 10% em etanol, até que a placa fique amarela brilhante, e aqueça a placa por dois a cinco minutos a 120 graus Celsius.