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$$\longrightharp{xx}$$,
A cromatografia de troca catiônica facilita a separação de proteínas das misturas com base em sua carga superficial líquida.
Para o isolamento da proteína do transdutor de sinal alvo do lisado de proteína de célula de inseto, obtenha um lisado de proteína alvo dialisado contendo outras proteínas contaminantes. Adicione tampão contendo cloreto de sódio para reduzir a viscosidade do lisado e melhorar a solubilidade da proteína, o que ajuda a evitar o entupimento da coluna cromatográfica durante a execução.
Além disso, o pH do tampão abaixo do ponto isoelétrico da proteína-alvo, pI, no qual a proteína tem carga líquida zero, facilita a ligação do excesso de íons de hidrogênio a grupos carboxilato negativos, tornando a proteína-alvo carregada positivamente.
Montar a coluna cromatográfica contendo grânulos de agarose reticulados acoplados a grupos carregados negativamente. Adicione um tampão de ligação para equilibrar a coluna e maximizar as interações coluna-proteína. Carregar o lisado diluído na coluna equilibrada.
Proteínas-alvo mais carregadas positivamente interagem e se ligam fortemente aos grupos carregados negativamente da coluna do que proteínas contaminantes menos carregadas positivamente.
Lave a coluna com tampão para remover proteínas contaminantes não ligadas e carregadas negativamente. Posteriormente, passe o tampão de eluição, aumentando gradualmente sua força iônica.
Em baixa força iônica, há competição mínima entre os íons positivos e proteínas pelos grupos negativos na coluna, eluindo proteínas contaminantes fracamente ligadas e menos carregadas positivamente. No entanto, à medida que a força iônica é aumentada, os íons de sal competem com as proteínas transdutoras de sinal alvo fortemente ligadas e reduzem as interações entre as proteínas e a coluna, eluíndo-as como uma fração purificada.
Prepare uma coluna de troca catiônica de 20 mililitros lavando-a com três volumes de coluna de Buffer G e, em seguida, com três volumes de coluna de Buffer F. Em seguida, diluir 20 mililitros da amostra dialisada até uma concentração final de cloreto de sódio de 100 milimolar, adicionando 20 mililitros de tampão E, e aplicar a amostra na coluna de troca.
É fundamental diluir a pequena quantidade da amostra em vez de todas de uma vez, e as amostras diluídas devem ser aplicadas à coluna imediatamente após a diluição para limitar a precipitação da proteína.
Continue a carregar a coluna com uma amostra recém-diluída à medida que a diluição anterior se aproxima do final da carga. Em seguida, lave a coluna até a absorbância basal 280 com o tampão F, que normalmente exigia três volumes de coluna.
Eluir a proteína da coluna com um gradiente de 400 mililitros do tampão F para o tampão G de 65%, coletando o eluído em frações de 6 mililitros. Quando o gradiente estiver concluído, continue lavando a coluna para obter 1,5 volume de coluna adicional de 65% de Buffer G.