Separação baseada em cromatografia de exclusão de tamanho de vesículas extracelulares bacterianas: uma técnica para separar a população heterogênea de vesículas bacterianas da membrana externa gram-negativas com base em seu tamanho

Sob condições de cultura adequadas, as bactérias gram-negativas liberam vesículas de membrana externa que transportam carga, ou OMVs, no sobrenadante. Essas vesículas são estruturas esféricas, pequenas e de tamanho heterogêneo, que medeiam a comunicação celular.

Para fracionar subpopulações de OMVs de tamanhos diferentes, pegue uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho vazia com um filtro apropriado em sua base para apoiar a matriz.

Embale a coluna com matriz de filtragem de gel consistindo em grânulos esféricos quimicamente inertes de tamanho de poro definido, garantindo que o tamanho seja ideal para excluir a entrada de OMVs de grande porte. Equilibre a coluna com um tampão apropriado para evitar que as esferas sequem para uma purificação ideal.

Carregue o sobrenadante de cultura bacteriana contendo subpopulações de OMVs, agregados de proteínas e ácidos nucléicos de tamanhos diferentes no topo da coluna. Permita que as amostras sejam executadas pela força da gravidade.

À medida que as amostras passam pela coluna, OMVs maiores que não podem entrar nos poros se movem pelos espaços interpartículas entre os grânulos de gel para serem eluídos primeiro. Enquanto isso, os OMVs menores penetram nos poros da matriz, seguem um caminho mais longo e eluem mais tarde.

Devido ao seu tamanho menor, os agregados de proteínas e ácidos nucléicos entram em vários poros da matriz, fazendo com que tenham o maior tempo de retenção na coluna e eluam como as últimas frações. Colete eluatos OMV separados e armazene-os para análise posterior.

Para começar, use uma haste de vidro para misturar um frasco de meio de filtração de gel e despeje o volume necessário para encher a coluna mais aproximadamente 50% de excesso em um frasco de vidro. Deixe as contas assentarem e transvase o excesso de líquido. Ressuspenda as esferas em tampão de eluição para uma solução final de aproximadamente 70% de gel e 30% de tampão e desgaseifique a solução sob vácuo.

Monte a coluna em um suporte de anel na posição vertical e encha a coluna com tampão de eluição para molhar as paredes, antes de drenar o tampão até restar apenas cerca de 1 centímetro. Em seguida, pipete cuidadosamente os grânulos de gel na coluna, enquanto drena simultaneamente o excesso de tampão para evitar que os grânulos se assentem, até que a coluna esteja compactada a uma altura de aproximadamente 2 centímetros abaixo do fundo do reservatório da coluna.

Antes de carregar a amostra, desgaseificar o tampão de eluição sob vácuo. Lave a coluna com aproximadamente duas vezes o volume da coluna do tampão de eluição. Quando o tampão atingir o topo da camada de gel, adicione cuidadosamente 2 mililitros de uma amostra de vesícula de membrana externa de 100 a 200 nanomoles por litro no topo da camada de gel sem perturbar a superfície e deixe a amostra entrar no gel.

Lentamente, adicione o tampão de eluição à coluna sem perturbar a camada de gel e coloque um tubo de 50 mililitros sob a coluna. Para evitar que a coluna seque, adicione simultaneamente tampão de eluição ao topo da coluna.

Depois de coletar 20 mililitros de eluato, coloque uma prateleira de tubos de 1,5 mililitro sob a coluna. Colete um total de 96 frações de 1 mililitro em cada tubo. Ao coletar as amostras, adicione continuamente o buffer de eluição à coluna. Para limpar a coluna, passe 1 volume de coluna de hidróxido de sódio 0,1 molar através da coluna, seguido por 2 volumes de coluna de tampão de eluição.