Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:05 min. • July 8th, 2025
As proteínas integrais da membrana bacteriana, ancoradas nas membranas da bicamada lipídica, facilitam o transporte de moléculas através das membranas e a transdução de sinais. Para estudos estruturais, proteínas recombinantes de membrana integral específicas são superexpressas com proteína fluorescente verde fundida, GFP.
Para avaliar a estabilidade da proteína de membrana recombinante após a solubilização do detergente, obtenha a fração de membrana bacteriana contendo proteínas integrais de membrana marcadas com GFP. Adicione um detergente não iônico. Além da concentração crítica, o detergente forma micelas.
As micelas interagem com membranas lipídicas e proteínas de membrana, solubilizando as membranas e formando complexos proteína-detergente. Além disso, as regiões transmembranares hidrofóbicas das proteínas de membrana podem permanecer desmascaradas, causando agregação de proteínas. Além disso, GFPs livres podem resultar devido à degradação de proteínas de membrana.
Centrifugue a mistura. Recolher o sobrenadante que contém fracção solubilizada por detergente.
Monte uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho conectada a um detector de fluorescência. A matriz da coluna compreende grânulos de agarose com tamanhos de poros que definem uma ampla faixa de fracionamento.
Equilibre a coluna com tampão contendo detergente para minimizar interações inespecíficas e manter a solubilização de proteínas.
Carregar a fracção solubilizada da membrana na coluna. Os agregados de proteínas escapam dos poros maiores e se movem através dos espaços interpartículas entre as contas, eluindo primeiro. Complexos menores de proteína-detergente entram em alguns poros nas contas, atravessando um caminho mais longo e eluem mais tarde. As GFPs gratuitas entram em todos os poros do grânulo e eluem por último. O detector de fluorescência analisa as frações eluídas, detectando a fluorescência emitida por GFP.
Picos de fluorescência simétricos de complexos proteína-detergente com agregados mínimos e GFP livre indicam a adequação do detergente para a solubilização de proteínas de membrana.
Para cromatografia de exclusão de tamanho detectada por fluorescência ou análise FSEC, em seguida, equilibre uma coluna de exclusão de tamanho com uma ampla faixa de fracionamento com buffer de fluxo em execução a uma taxa de 0,3 mililitros por minuto. Em seguida, injete 100 microlitros de uma amostra de membrana solubilizada na coluna na mesma taxa de fluxo e monitore o perfil de ilusão usando óptica de fluorescência.