Cromatografia gasosa Headspace: uma técnica para avaliar a concentração de etanol em embriões de peixe-zebra

Para analisar a concentração de etanol - um composto orgânico volátil, comece tomando o sobrenadante de cultura de embriões de peixe-zebra homogeneizado tratado com etanol em um frasco de cromatografia. O sobrenadante contém outros compostos orgânicos não voláteis além do etanol. Coloque o frasco selado em uma unidade amostradora de cromatografia e aqueça-o a uma temperatura apropriada.

Durante o aquecimento, o etanol vaporiza e migra para a fase gasosa ou headspace, deixando para trás os resíduos não voláteis. Isso permite que o amostrador introduza etanol gasoso em um fluxo contínuo de gás de arraste. Isso atua como uma fase móvel.

O etanol passa pela coluna de cromatografia enrolada pré-aquecida, que contém um leito compactado da fase estacionária líquida. Devido à sua volatilidade e polaridade, as moléculas de etanol em movimento começam a adsorver sobre as partículas da fase estacionária, particionando-se na fase estacionária.

Devido à alta temperatura da coluna, a adsorção de moléculas de etanol é instável e temporária, permitindo que essas moléculas se dessorvam gradualmente e migrem ao longo do fluxo do gás transportador. Essas moléculas de etanol passam por uma série de eventos de adsorção-dessorção ao longo do comprimento da coluna.

Posteriormente, o etanol entra em uma câmara de detecção que ajuda a determinar sua concentração na amostra correspondente à área sob a curva no cromatograma resultante.

Use duas micropipetas p200 ajustadas para 50 microlitros e aspire a solução de coquetel de protease em uma e água na segunda. Em seguida, coloque rapidamente 10 embriões em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando uma pipeta de vidro e feche a tampa. Repita esse processo para todas as amostras a serem testadas, controles e embriões tratados com etanol.

Trabalhando com uma amostra de cada vez, abra rapidamente a tampa e aspire todos os meios embrionários residuais com uma micropipeta p200 ajustada para 200 microlitros. Rapidamente, mas suavemente, adicione e remova os 50 microlitros de água, em seguida, adicione os 50 microlitros de coquetel de protease e feche a tampa do tubo.

Deixe a amostra descansar por 10 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, adicione rapidamente 450 microlitros de cloreto de sódio 5 molar e feche a tampa do tubo. Homogeneizar a amostra por vórtice durante 10 minutos e transferir 2 microlitros de sobrenadante para um frasco de cromatografia em fase gasosa. Feche o frasco para injetáveis com uma tampa de politetrafluoretileno.

Depois de concluir o método de inicialização, carregue 436 Etanol spme atual 2013 3 minutos de absorção 2_5min rg run. METH no menu Métodos no software de análise para cada amostra na lista de amostras. Preencha a lista de amostras, começando com o ar, a água e os 5 espaços em branco do coquetel de protease de cloreto de sódio molar. Em seguida, insira os padrões de etanol na ordem de 0,3125 a 40 milimolar.

Siga os padrões com a segunda rodada de espaços em branco. Insira todas as amostras de sobrenadante de embriões homogeneizados a serem testadas, da menor para a maior concentração de etanol prevista, e termine inserindo uma terceira rodada de brancos.

Adicione os frascos de cromatografia gasosa ao amostrador automático na ordem em que as amostras foram introduzidas e deixe-os aquecer durante 10 a 15 minutos. Em seguida, inicie as execuções de amostra usando o software. Depois que todas as execuções forem concluídas, ative o método de desligamento adicionando um exemplo final na lista de exemplos e executando o modo de espera. metanfetamina. Faça backup de todos os dados adquiridos durante a execução de amostra.

Quando o método de desligamento estiver concluído, clique em Abrir cromatograma e abra a pasta com os resultados. As amostras são integradas automaticamente neste programa. Nos resultados, certifique-se de que os picos corretos foram integrados. Depois que todas as amostras forem confirmadas, imprima ou exporte os resultados.

Plote a altura do pico dos padrões de etanol em um gráfico. Em seguida, calcule os valores de inclinação, interceptação Y e R-quadrado. Obtenha o valor do etanol para cada amostra subtraindo a altura do pico da amostra da interceptação Y dos padrões e dividindo esse valor pela inclinação dos padrões.

Para calcular a concentração de etanol nos embriões, calcule o fator de diluição para cada amostra e multiplique o valor do etanol da amostra por este fator de diluição. Por último, calcular as amostras de referência do meio multiplicando o valor do etanol do meio por um factor de diluição de 10.