Eletroforese em gel de poliacrilamida: uma técnica analítica para detectar sulfatos de heparano de diferentes comprimentos de cadeia isolados de tecido pulmonar de camundongo

Glicosaminoglicanos sulfatados como sulfatos de heparan, HSs, são polissacarídeos sulfatados lineares carregados negativamente de comprimentos de cadeia variáveis, ligados a proteínas da superfície celular.

Para estimar HSs de diferentes comprimentos isolados do tecido pulmonar de camundongo, comece com a montagem do de gel. Encha-o parcialmente com solução de acrilamida-bisacrilamida altamente concentrada, incluindo agentes catalisadores - persulfato de amônio e tetra-metil-etileno-diamina. Cubra com água para evitar o contato com o ar, o que pode inibir a polimerização. Incubar.

Os agentes catalisadores induzem a polimerização da acrilamida-bisacrilamida, formando um gel de resolução de poros pequenos. Descarte a água. Adicione baixa concentração de solução de acrilamida-bisacrilamida com agentes catalisadores. Insira um pente de gel para criar poços. A solução polimeriza, formando gel de empilhamento de poros grandes.

Carregue as câmaras do tanque de eletroforese com tampão de corrida para obter a condutividade elétrica ideal durante a eletroforese.

Dissolva a mistura HS no tampão de carregamento contendo corante de rastreamento e sacarose. Em seguida, transfira essa mistura e as escadas HS padrão para poços de. A sacarose confina a mistura aos poços. O corante ajuda a monitorar a progressão da eletroforese.

Inicie a eletroforese em baixa tensão. Os HSs carregados negativamente atravessam o gel de empilhamento, movendo-se em direção ao ânodo carregado positivamente, e concentram-se na interface do gel de empilhamento-resolução devido à diferença de tamanho dos poros.

Aumente a tensão. Os HSs de cadeia pequena migram rapidamente através do gel de resolução, atravessando mais longe, enquanto os HSs de cadeia longa ficam presos dentro da matriz de gel e se movem lentamente.

Após a eletroforese, manche o gel. Os HSs aparecem como bandas distintas, com HSs de cadeia pequena posicionados abaixo dos HSs de cadeia longa. O comprimento dos HSs individuais pode ser determinado comparando com os padrões HS.

Comece colocando um vazio no tanque PAGE. Moldar o gel de resolução misturando 10 mililitros de solução de gel de resolução com 60 microlitros de persulfato de amônio a 10% recém-preparado em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, adicione 10 microlitros de TEMED. Inverta o tubo suavemente 2 a 3 vezes.

Adicione rapidamente 10 mililitros da solução de gel de poliacrilamida ativada ao usando uma pipeta. Cubra com 2 mililitros de água filtrada deionizada e deixe o gel de resolução polimerizar por 30 minutos.

Depois que o gel de resolução estiver totalmente polimerizado, descarte a água sobreposta. Moldar o gel de empilhamento misturando 3 mililitros de solução de gel de empilhamento com 90 microlitros de persulfato de amônio a 10% recém-preparado em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, adicione 3 microlitros de TEMED e inverta o tubo suavemente 2 a 3 vezes.

Use uma pipeta para adicionar rapidamente a solução de gel de empilhamento sobre o gel de resolução solidificado, até que o esteja cheio até a borda. Insira totalmente o pente incluído com o de gel de poliacrilamida vazio e deixe o gel de empilhamento polimerizar por 30 minutos. Depois que o gel polimerizar, remova a tira de fita da parte inferior do e coloque o de volta no conjunto do tanque PAGE. Encha as câmaras superior e inferior com as respectivas soluções tampão.

Dissolva as amostras secas de glicosaminoglicanos no volume mínimo necessário de água filtrada desionizada e misture com o tampão de carregamento de amostras na proporção de 1 para 1. Carregue as amostras e as escadas de oligossacarídeos HS no gel.

Execute novamente o gel por 5 minutos a 100 volts. Em seguida, execute-o a 200 volts por 20 a 100 minutos, dependendo da porcentagem de acrilamida da solução de gel de resolução.