Eletroforese em gel de poliacrilamida de ureia desnaturante para análise de RNA: uma técnica para separar oligonucleotídeos de RNA fosforilados marcados com fluorescência de seus equivalentes não fosforilados

Para começar, pegue uma amostra contendo oligonucleotídeos de RNA fosforilados e não fosforilados marcados com fluorescência misturados com o corante de carga contendo uréia. Aqueça a amostra.

A uréia - um forte desnaturante - em combinação com o calor desnatura a estrutura secundária do RNA, resultando em sua conformação linearizada e não estruturada. Agora, molde o gel misturando a solução de acrilamida-bisacrilamida com uréia.

Adicione tetrametileno diamina, um catalisador, e persulfato de amônio, um agente oxidante, para facilitar a polimerização subsequente do gel.

Despeje a solução em um aparelho de pré-montado. Insira um pente, criando poços para carregamento de amostras. Deixe o gel polimerizar. Coloque o no aparelho de gel. Adicione um tampão de corrida aos reservatórios superior e inferior, mantendo o fluxo de corrente através de todo o gel. Retire o pente.

Carregue a amostra misturada com corante de visualização no poço e conecte o gel a uma fonte de alimentação na tensão desejada. A uréia no gel permite que as moléculas de RNA migrem como espécies lineares.

O gel atua como uma peneira, permitindo que as moléculas de RNA carregadas negativamente se movam através dos poros em direção ao eletrodo positivo. Durante a corrida, o RNA fosforilado sendo inerentemente mais negativo se move mais rápido do que o RNA não fosforilado.

Imagem do gel para a detecção de RNA marcado com fluorescência. Observe a mudança de mobilidade entre o RNA fosforilado de migração mais rápida, que aparece como uma banda inferior em comparação com o RNA não fosforilado.

Para preparar uma solução de gel de acrilamida desnaturante a 15%, combine 22,5 mililitros de solução pré-misturada de acrilamida/bis-acrilamida 40% 29:1, 6 mililitros de 10X TBE, 28,8 gramas de uréia e água livre de RNase para um volume total de 59 mililitros. Em seguida, mexa suavemente a solução.

Aqueça a solução no micro-ondas por 20 segundos, mexa e volte imediatamente ao micro-ondas por mais 20 segundos. Mexa suavemente a solução até que a ureia esteja completamente dissolvida. Coloque o copo de vidro em um banho de água rasa, contendo água fria, por 5 minutos, certificando-se de que o nível de água fria ao redor do copo de vidro esteja acima do nível de solução dentro do copo de vidro. Quando a solução estiver fria, filtre e desgaseifique com uma unidade de filtragem descartável de 0,22 micrômetro para remover partículas e bolhas de ar microscópicas.

Lave um prato de vidro curto e longo com água e sabão. Em seguida, borrife cada placa com etanol a 95% e limpe o vidro para remover qualquer umidade. Eleve a placa longa da bancada colocando-a em cima de uma caixa. Em seguida, posicione espaçadores de 0,4 milímetros ao longo das bordas longas da placa. Coloque a placa curta em cima da placa longa, certificando-se de que as bordas da placa curta, da placa longa e dos espaçadores estejam alinhadas. Em seguida, prenda cada lado com três grampos de metal uniformemente espaçados.

Adicione 24 microlitros de TEMED à solução de acrilamida e misture. Em seguida, adicione 600 microlitros de APS a 10% e despeje imediatamente a solução entre as placas de vidro.

Derramar a solução de acrilamida entre o sanduíche de placa de vidro pode ser realmente desafiador. Para evitar bolhas de ar, bata no sanduíche de prato de vidro enquanto despeja a solução.

Com cuidado, adicione um pente limpo de 32 poços no topo do sanduíche de prato de vidro e deixe a acrilamida polimerizar por 30 minutos.

Para executar o gel, ajuste o bloco de calor para 75 graus Celsius, remova o metal clamps, e lave e seque completamente o sanduíche de placa de vidro. Posicione o sanduíche de placa no aparelho de gel com a placa curta voltada para a frente e prepare o buffer de corrida 0.5X TBE combinando 100 mililitros de 10X TBE com 1.9 litros de água livre de RNase.

Adicione 600 mililitros do buffer de corrida às câmaras superior e inferior do aparelho. Remova suavemente o pente do gel e enxágue bem os poços com uma seringa. Pré-execute o gel a 50 watts por 30 minutos. Em seguida, enxágue os poços novamente.

Gire as reações extintas e incuba-as a 75 graus Celsius por 3 minutos. Repita a rotação do pulso e carregue imediatamente 10 microlitros de cada amostra no gel. Em seguida, execute o gel por 3 horas a 50 watts. Quando a execução terminar, desligue a fonte de alimentação e drene a câmara superior do aparelho.

Lave e seque o lado externo do sanduíche de prato de vidro. Em seguida, cubra-o com papel alumínio e transfira-o para um scanner a laser para obter imagens. Monte o sanduíche de placa de vidro no stage do scanner a laser, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão para o fluoróforo desejado e obtenha a imagem do gel.