Eletroforese em gel de poliacrilamida de ureia desnaturante para análise de RNA: uma técnica para separar oligonucleotídeos de RNA fosforilados marcados com fluorescência de seus equivalentes não fosforilados

Para começar, pegue uma amostra contendo oligonucleotídeos de RNA fosforilados e não fosforilados marcados com fluorescência misturados com o corante de carga contendo uréia. Aqueça a amostra.

A uréia - um forte desnaturante - em combinação com o calor desnatura a estrutura secundária do RNA, resultando em sua conformação linearizada e não estruturada. Agora, molde o gel misturando a solução de acrilamida-bisacrilamida com uréia.

Adicione tetrametileno diamina, um catalisador, e persulfato de amônio, um agente oxidante, para facilitar a polimerização subsequente do gel.

Despeje a solução em um aparelho de pré-montado. Insira um pente, criando poços para carregamento de amostras. Deixe o gel polimerizar. Coloque o no aparelho de gel. Adicione um tampão de corrida aos reservatórios superior e inferior, mantendo o fluxo de corrente através de todo o gel. Retire o pente.

Carregue a amostra misturada com corante de visualização no poço e conecte o gel a uma fonte de alimentação na tensão desejada. A uréia no gel permite que as moléculas de RNA migrem como espécies lineares.

O gel atua como uma peneira, permitindo que as moléculas de RNA carregadas negativamente se movam através dos poro