Eletroforese em gel de agarose semi-desnaturante bidimensional: uma técnica para separar fibras amilóides polimórficas com base na heterogeneidade de tamanho

As fibras amilóides são agregados de proteínas mal dobradas, que exibem heterogeneidade de tamanho. Essas fibras, sendo resistentes a detergentes aniônicos como o SDS, podem ser analisadas por meio de eletroforese bidimensional em gel de agarose semidesnaturante.

Para começar, pegue um gel de agarose pré-montado e do tamanho de um poro grande que contenha SDS. A alta porosidade permite a separação de fibras intactas durante a corrida. Cubra o gel com um tampão de corrida contendo SDS.

Carregue um lisado celular contendo fibras amilóides no gel. A presença de SDS e a ausência da etapa de aquecimento da amostra criam condições semi-desnaturantes onde o detergente se liga a amilóides altamente resistentes, conferindo uma carga negativa uniforme às fibras intactas.

Execute o gel na primeira dimensão na tensão apropriada. O campo elétrico causa a migração de amilóides carregados negativamente em direção ao ânodo carregado positivamente.

Durante a corrida, as fibras menores migram rapidamente em comparação com as maiores - formando um padrão de banda semelhante a um esfregaço, indicando heterogeneidade de tamanho.

Após a conclusão, gire o gel perpendicularmente e passe-o na segunda dimensão. Nesta dimensão, as fibras se movem de forma idêntica à primeira corrida, separando-se com base em seus tamanhos. Isso cria uma mancha diagonal, pois as fibras menores migram mais rápido do que as maiores.

A formação da banda diagonal acentuada confirma uma população fibrilar amilóide intacta, mas heterogênea.

Para preparar o gel, adicione 2 gramas de pó de agarose a 200 mililitros de tampão TAE em um copo de vidro. Em seguida, aqueça o copo no micro-ondas para derreter a agarose.

Em seguida, adicione 1 mililitro de SDS a 20% a uma concentração final de 0,1%. Gire suavemente o copo.

Em seguida, despeje a agarose líquida em uma placa de gel de 15 cm x 14 cm. Para remover quaisquer bolhas de ar, use uma pipeta de 1 mililitro. Em seguida, coloque um pente de 20 poços em cima do gel.

Em seguida, adicione aproximadamente 60 microgramas de lisado de células inteiras na faixa extrema direita do gel. Execute o gel a 60 volts por cerca de quatro horas, usando o tampão TAE contendo 0,1% de SDS, como tampão de corrida.

Para executar o gel na segunda dimensão, gire cuidadosamente o gel em 90 graus no sentido anti-horário. Em seguida, execute a prisão a 60 volts por cerca de quatro horas.