Eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul: uma técnica de separação não desnaturante para análise de complexos de cadeias respiratórias mitocondriais intactas

Para analisar os cinco complexos mitocondriais da cadeia respiratória com subunidades intactas, obtenha-se complexos mitocondriais solubilizados em detergente suave e não iônico. Misture com tampão contendo Coomassie Blue-G, um corante aniônico.

Coomassie substitui o detergente e liga-se de forma não específica aos complexos, conferindo carga negativa e manchando-os de azul. Além disso, Coomassie evita que os complexos se agreguem e ajuda a preservar sua estrutura e função nativas.

Em um tanque de eletroforese, monte um de gel compreendendo gel de resolução gradiente com tamanho de poro decrescente ao longo do comprimento, coberto com gel de empilhamento de tamanho de poro grande. Encha as câmaras do ânodo e do cátodo com ânodo resfriado e tampão catódico contendo Coomassie.

Carregue os poços com a mistura de complexo de proteína ligada a Coomassie. Inicie a eletroforese.

Os complexos proteicos carregados negativamente migram do gel de empilhamento para o gel de resolução de gradiente, em direção ao ânodo carregado positivamente. Enquanto os complexos menores atravessam rapidamente os poros, os complexos maiores são retardados por tamanhos de poros restritivos à medida que descem p