JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
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Para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA usando eletroforese capilar, comece pegando uma placa de ensaio de vários poços. Cada poço contém amplicons de PCR marcados com fluorescência e tamanhos diferentes - oligonucleotídeos de DNA de fita dupla obtidos após um ciclo de PCR.
Adicione alguns fragmentos de DNA de fita dupla de tamanhos diferentes ao poço, que atuam como um padrão de tamanho. Cada uma dessas moléculas de DNA carrega uma etiqueta fluorescente para facilitar a identificação.
Complemente o poço com formamida, um desnaturante forte, e aqueça em alta temperatura. Esta etapa desnatura o DNA, formando fragmentos de fita simples que podem migrar facilmente através dos poros do gel.
Coloque a placa em uma unidade de analisador de fragmentos que contenha gel de polímero pré-injetado dentro de seu sistema capilar.
Aplique uma alta voltagem para introduzir eletrocineticamente o DNA do poço no capilar de diâmetro fino no cátodo - o terminal negativo. As moléculas de DNA carregadas negativamente migram em direção ao ânodo carregado positivamente. As fitas de DNA mais curtas enfrentam menos força de atrito e se movem mais rapidamente através do gel do que as fitas de DNA mais longas.
Durante a eletromigração, o DNA cruza o caminho do feixe de laser, o que faz com que o corante fique fluorescente. Os sinais de emissão do corante são capturados por um detector e posteriormente traduzidos em um eletroferograma - um gráfico que representa cada DNA fluorescente como um pico individual de cor diferente.
Compare o pico do fragmento de DNA desconhecido com os picos de referência para analisar seu tamanho.
Após a confirmação dos amplicons de PCR, use novas tiras ou placas de PCR para diluir os produtos de PCR de 1 a 10 em água purificada. Vórtice e centrífuga brevemente. Enquanto trabalha em uma capela de exaustão, prepare uma mistura principal em um tubo de centrífuga consistindo de formamida e solução padrão de tamanho de referência.
De acordo com o número de produtos de PCR a serem analisados, use volumes de reagentes, conforme detalhado no manuscrito. Permita um volume excedente de 10%.
Vortex brevemente e distribua 9,5 microlitros em poços individuais em uma placa de PCR, apropriada para o sistema de eletroforese capilar disponível. Em seguida, adicione 0,5 microlitros de produto PCR diluído. Sele e centrifugue brevemente.
Em seguida, carregue a placa contendo as amostras em um termociclador de PCR e desnature as amostras a 95 graus Celsius por 3 minutos, antes de resfriar a 4 graus Celsius indefinidamente. Centrifugue a 1.000 x g por 1 minuto. Remova cuidadosamente o selo e carregue a placa em um sistema de eletroforese capilar calibrado de acordo com as instruções do fabricante.
Execute a eletroforese capilar de análise de fragmentos usando reagentes conforme apropriado para o aparelho de escolha e ajuste as condições de execução de acordo com a descrição no manuscrito.