Eletroforese capilar: uma técnica para analisar amplicons de reação em cadeia da polimerase marcados com fluorescência

Para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA usando eletroforese capilar, comece pegando uma placa de ensaio de vários poços. Cada poço contém amplicons de PCR marcados com fluorescência e tamanhos diferentes - oligonucleotídeos de DNA de fita dupla obtidos após um ciclo de PCR.

Adicione alguns fragmentos de DNA de fita dupla de tamanhos diferentes ao poço, que atuam como um padrão de tamanho. Cada uma dessas moléculas de DNA carrega uma etiqueta fluorescente para facilitar a identificação.

Complemente o poço com formamida, um desnaturante forte, e aqueça em alta temperatura. Esta etapa desnatura o DNA, formando fragmentos de fita simples que podem migrar facilmente através dos poros do gel.

Coloque a placa em uma unidade de analisador de fragmentos que contenha gel de polímero pré-injetado dentro de seu sistema capilar.

Aplique uma alta voltagem para introduzir eletrocineticamente o DNA do poço no capilar de diâmetro fino no cátodo - o terminal negativo. As moléculas de DNA carregadas negativamente migram em direção ao ânodo carregado positivamente. As fitas de DNA mais curtas enfrentam menos força de atrito e se movem mais rapidamente através do gel do que as fitas de DNA mais