Eletroforese capilar microfluídica para dimensionamento de fragmentos de produtos de PCR: uma técnica de separação eletroforética baseada em microchip para separar fragmentos de DNA com base no tamanho

A eletroforese microfluídica é uma técnica para separar fragmentos de DNA de tamanhos diferentes dentro de microcapilares.

Para começar, pegue um chip microfluídico de vários poços com poços designados para a mistura de polímero à base de gel e corante fluorescente, amostras de DNA e uma escada de DNA de peso molecular conhecida. Esses poços estão interligados por meio de uma rede de microcanais.

Dispense a mistura de gel-corante em poços alocados. Monte o chip em uma estação de escorva pré-equipada com uma seringa vazia. Pressione o êmbolo da seringa, aplicando pressão para forçar a mistura de gel-corante no microcanal de separação.

Remova o cavaco e pipete outros componentes em seus respectivos poços. Adicione um marcador - um padrão interno que calibra o tamanho da amostra - aos poços que contêm a escada e as amostras.

Insira o microchip em um analisador de fragmentos para executar o chip. Uma vez dentro, a tensão aplicada gera forças eletroforéticas, conduzindo a amostra do poço para o microcanal de carregamento de amostras, de onde atinge a interseção cruzada entre esse canal e o canal de separação. A corrente elétrica ajuda a amostra a entrar no microcanal de separação.

As moléculas de corante fluorescente intercalam fragmentos de DNA carregados negativamente que se movem em direção ao ânodo em diferentes velocidades eletroforéticas em relação ao seu tamanho molecular - fragmentos menores migrando mais rápido do que os maiores. Consequentemente, os fragmentos se separam em faixas de tamanhos diferentes que fluorescem.

Um detector baseado em laser mede a fluorescência de cada banda e a registra como um eletroferograma que exibe DNA de tamanhos diferentes como um pico distinto.

Antes de começar, leve o concentrado de corante de DNA, a matriz de gel de DNA, o marcador de DNA, a escada de DNA e as amostras de DNA purificadas à temperatura ambiente. Configure a estação de escorva substituindo a seringa e ajustando a placa de base. Em seguida, solte a alavanca do clipe da seringa e deslize-o para a posição superior.

Inicie o software de dimensionamento e prepare a mistura de gel e corante. Vortex o concentrado de corante por 10 segundos e gire-o para baixo. Em seguida, adicione 25 microlitros do corante a um frasco de matriz de gel e vortex a solução para misturar.

Transfira a mistura de gel-corante para um filtro de centrifugação. Coloque-o na centrífuga e gire-o por 10 minutos a 1.500 vezes g. Quando estiver pronto para carregar a mistura de gel-dye, insira um novo chip de DNA na estação de primer e adicione 9 microlitros da mistura de gel-dye no poço marcado com "G".

Feche a estação de escorva e certifique-se de que o êmbolo esteja posicionado na marca de 1 mililitro. Pressione o êmbolo da seringa para baixo, até que seja segurado pelo clipe. Aguarde exatamente 30 segundos e solte o clipe. Aguarde mais 5 segundos e, em seguida, puxe lentamente o êmbolo de volta para a posição de 1 mililitro.

Abra a estação de primer e adicione 9 microlitros de mistura de gel-corante nos poços marcados com "G". Adicione 5 microlitros de marcador no poço marcado com um símbolo de escada e cada um dos 12 poços de amostra.

Adicione 1 microlitro da escada ao poço com o símbolo da escada e 1 microlitro do produto de PCR ou água aos poços de amostra. Vortex o chip por 1 minuto a 2.400 RPM. Insira-o no bioanalisador e execute o chip em cinco minutos.