SDS Page não redutor: um método para analisar complexos de proteínas multiméricas ligadas a dissulfeto

As proteínas multiméricas são estabilizadas por ligações intermoleculares, covalentes e dissulfeto entre seus resíduos de cisteína, o que é crucial para manter sua integridade estrutural e funcional.

Para analisar esses complexos por PAGE não redutor, pegue a concentração desejada de proteínas estabilizadas com dissulfeto. Adicione um tampão de amostra não redutor e aqueça a amostra.

Este tampão contém SDS, que confere uma carga negativa geral às proteínas, e um corante de rastreamento para visualizar seu movimento no gel. O tampão não possui nenhum agente redutor, o que permite que as ligações dissulfeto permaneçam intactas, facilitando que o complexo multimérico permaneça intacto.

Carregue os complexos individuais em poços do gel de poliacrilamida da porcentagem desejada, pré-montado em um aparelho de gel. Adicione uma escada de proteína de tamanho conhecido em outro poço. Mergulhe os poços em um buffer de execução baseado em SDS e conecte o aparelho a uma fonte de alimentação.

A corrente elétrica força os complexos de proteínas carregados negativamente a se moverem através dos poros do gel em direção ao ânodo - o terminal positivo. Como os complexos de proteínas são uniformemente carregados negativamente, a separação ocorre com base no tamanho, onde os multímeros formam uma faixa de peso molecular mais alto proeminente em uma posição específica.

Compare o tamanho da banda de proteína separada com a escada. A ausência de bandas de menor peso molecular no gel confirma a separação bem-sucedida dos complexos multiméricos intactos.

Prepare 1 litro de tampão de corrida 1X Tris-glicina misturando 25 Tris milimolares, 192 glicina milimolar e 0,1% de peso por volume SDS. Em seguida, configure o aparelho de corrida SDS-PAGE.

Abra o pacote TGX SDS-PAGE pré-moldado de 16% de acordo com o protocolo do fabricante e remova o. Remova o pente que está revestindo os poços e a fita da parte inferior do e coloque o gel no aparelho de corrida. Encha a câmara com o tampão de corrida 1X, até que os poços estejam submersos em líquido.

Usando uma pipeta de plástico, enxágue os poços com o tampão de corrida. Carregue as amostras no gel junto com 10 microlitros do marcador padrão pré-corado. Por fim, execute o gel a 200 volts até que a frente do corante esteja a aproximadamente 1 centímetro da parte inferior do gel.