Focalização isoelétrica em fase líquida: uma técnica de eletroforese para separar moléculas bioativas do extrato bruto de Gymnema sylvestre

Comece com uma focalização isoelétrica pré-montada, célula IEF - uma unidade de eletroforese em fase líquida. Esta coluna é uma câmara porosa horizontal compartimentada com terminais positivos e negativos distintos nas extremidades.

Agora, pegue o extrato da planta contendo uma mistura complexa de componentes de carga diferente com pontos isoelétricos variados, pI - um pH em que a carga líquida em uma molécula é zero.

O extrato é complementado com anfólitos de cargas variáveis que facilitam o fracionamento posterior dos componentes da amostra.

Carregue a amostra nas portas de carregamento da coluna. Atualmente, a coluna IEF tem um pH constante. Em seguida, aplique alta tensão para iniciar a eletroforese.

Sob o campo elétrico, os anfólitos solúveis migram em direção a eletrodos de carga oposta e estabelecem um gradiente linear de pH ao longo da coluna. Os componentes da amostra começam a migrar através do gradiente de pH da fase líquida, e aqueles posicionados em pH abaixo de seu pI carregam uma carga líquida positiva.

Estes migram em direção ao eletrodo negativo até que os componentes atinjam seu pI, onde sua carga se neutraliza e a migração para. Da mesma forma, os componentes em pH acima de seu pI migram em direção ao eletrodo positivo e param quando atingem seu pI. Isso separa os componentes da amostra com base em seu pI em compartimentos focados. Colha as fracções purificadas para análise posterior.

Adicione 0,6 gramas de extrato da planta Gymnema sylvestre a 60 mililitros de água destilada. Dissolva o extrato vegetal misturando em um tubo de rolo por cinco minutos.

Para remover as partículas insolúveis, centrifugue a solução a 10.000 x g por cinco minutos. Transfira o sobrenadante para um copo de vidro de 150 mililitros e adicione anfólito para criar uma solução a 1% em volume, aproximadamente 0,6 mililitros.

Usando uma seringa de 50 mililitros, com uma agulha de ponta romba de calibre 19 de 1,5 polegada, carregue a solução na célula IEF através das portas de coleta de amostras. Em seguida, remova a célula do suporte e bata na câmara do eletrodo para desalojar e remover quaisquer bolhas.

Conecte a unidade à água de resfriamento. Com a potência fornecida a 15 watts constantes, inicie o fracionamento. Opere a unidade IEF até que a tensão atinja um valor constante, aproximadamente três horas.

Depois de pressionar o botão Harvest ON, alinhe os pinos do coletor de frações com as portas de coleta. Empurre os pinos através da fita de vedação para começar a coletar as frações de Gymnema sylvestre.