Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional: uma técnica de separação para análise de proteínas em mistura de proteínas complexas com base na carga e no peso molecular

Para eletroforese em gel bidimensional de mistura de proteínas derivada de tecido tumoral homogeneizado, trate com tampão contendo caotrópicos, detergente zwitteriônico e agente redutor. Caotrópios e detergentes desnaturam e solubilizam as proteínas. Os agentes redutores reduzem as ligações dissulfeto das proteínas, gerando grupos tióis livres e desdobrando as proteínas para uma resolução ideal da proteína.

Transfira a mistura de proteínas tratada para um gradiente de pH imobilizado, IPG, porta-tiras. Coloque uma tira IPG compreendendo gradiente de pH linear dentro da matriz de gel de acrilamida. Adicione óleo mineral para evitar a evaporação da solução proteica. Transfira o suporte para um sistema IEF de foco isoelétrico. Deixe a solução de proteína reidratar a tira.

Execute o IEF de primeira dimensão. A corrente elétrica faz com que as proteínas carregadas migrem através do gradiente de pH em direção aos eletrodos de carga oposta, imobilizando-se em seus respectivos pontos isoelétricos - pH no qual as proteínas têm carga líquida zero.

Pós-IEF, trate a tira de IPG com dodecil sulfato de sódio, SDS, um detergente aniônico que confere carga negativa às proteínas. Equilibre com um agente alquilante para modificar os grupos tióis proteicos, garantindo a solubilidade proteica durante a eletroforese.

Carregue a tira em um gel pré-moldado de resolução de poliacrilamida de poros pequenos e prenda com agarose derretida. Encha as câmaras com tampão de eletroforese contendo SDS. Inicie a eletroforese de segunda dimensão, perpendicular ao IEF.

Proteínas de peso molecular maiores e carregadas negativamente movem-se através do gel lentamente em direção ao ânodo carregado positivamente do que proteínas menores, facilitando a separação baseada em tamanho.

Manchar o gel. As proteínas podem ser visualizadas como pontos discretos no gel.

Para iniciar este procedimento, adicione 250 microlitros de uma solução de amostra de proteína previamente preparada a cada ranhura de um suporte de tira IPG de 13 centímetros. Coloque uma tira de IPG de 18 centímetros, com o lado do gel voltado para baixo, em cada solução de amostra de proteína, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, adicione 3 a 4 mililitros de óleo mineral para cobrir cada tira de IPG.

Em seguida, monte cada suporte de tira IPG em um sistema de foco isoelétrico, com a extremidade pontiaguda na placa traseira e a extremidade quadrada na placa frontal. Depois de reidratar as tiras IPG por 18 horas em temperatura ambiente, defina os parâmetros IEF no sistema de foco isoelétrico com um tempo de execução total de 7.5 horas e 36,875 volts-hora.

Após o IEF, retire cada tira IPG do sistema de foco isoelétrico e remova o excesso de óleo mineral com uma toalha de papel insolúvel. Em seguida, embrulhe cada tira em uma folha de filme plástico e guarde a -80 graus Celsius.

Para fundir um gel PAGE a 12%, adicione água bidestilada a 1,5 molar, tampão triclorídrico 1,5 molar, solução estoque de acrilamida / bisacrilamida a 40%, persulfato de amônio a 10% e TEMED a um copo. Misture a solução de gel suavemente, tomando cuidado para evitar bolhas.

Despeje suavemente a solução de gel em uma câmara de fundição múltipla, até a altura esperada do gel de 19 centímetros. Imediatamente, adicione cerca de 3 mililitros de água bidestilada à câmara de fundição múltipla para cobrir cada gel de resolução e deixe cada gel polimerizar por cerca de uma hora.

Esta etapa é muito importante para preparar um gel SDS-PAGE de alta qualidade. Um volume igual de água deve ser adicionado imediatamente no topo de cada gel.

Prepare dois litros de tampão de eletroforese e, em seguida, adicione o tampão a um tanque tampão da unidade de separação de eletroforese.

Depois de remover as tiras de IPG focadas do freezer, coloque-as em um recipiente de plástico contendo 1 mililitro de tampão de equilíbrio redutor e um traço de azul de bromofenol e equilibre-as por 10 minutos com um balanço suave. Depois de remover o tampão de equilíbrio redutor, adicione 4 mililitros de tampão de equilíbrio de alquilação e um traço de azul de bromofenol às tiras de IPG e equilibre-as por 10 minutos com um balanço suave.

Durante o equilíbrio do gel, desmonte a câmara de fundição múltipla e remova o de gel de resolução preparado. Enxágue o de gel três vezes com água bidestilada e, em seguida, remova o excesso de água do de gel com uma toalha de papel insolúvel e coloque-o em um suporte de gel.

Em seguida, enxágue as tiras de IPG equilibradas com tampão de eletroforese e remova o excesso de líquido de cada superfície da tira de IPG com uma toalha de papel insolúvel. Coloque uma tira IPG no gel SDS-PAGE de resolução, permitindo que o lado plástico da tira IPG entre em contato com a placa de vidro mais longa, com a extremidade pontiaguda para a esquerda.

Agora, adicione rapidamente 3 a 4 mililitros de agarose a 1% quente e tampão de eletroforese SDS, para selar a tira IPG na parte superior de cada gel SDS-PAGE e coloque a parte superior da tira IPG na parte superior da placa de vidro mais curta, tomando cuidado para evitar bolhas.

Essas etapas são muito importantes para selar a tira IPG em um gel SDS-PAGE. As soluções de agarose quente devem ser adicionadas imediatamente e a tira IPG deve ser colocada imediatamente na parte superior do gel SDS.

Após a polimerização, insira o de gel montado verticalmente entre as juntas plásticas e um sistema de eletroforese vertical. Coloque a parte superior do gel com a tira IPG ao lado do cátodo. Em seguida, ajuste o nível de tampão de eletroforese para imergir o de gel adicionando o volume apropriado de tampão ao sistema de eletroforese.

Conecte e defina a fonte de alimentação no modo de tensão constante e funcione a 200 volts por cerca de 370 minutos enquanto monitora o corante. Após a conclusão da execução, retire o de gel do sistema de eletroforese e remova suavemente o gel do de gel, tomando cuidado para evitar rasgar o gel.