Eletroforese em gel com zimografia: uma técnica eletroforética para detectar metaloproteinases da matriz avaliando a atividade enzimática

A metaloproteinase da matriz, ou MMP, uma protease de múltiplos domínios que compreende domínios propeptídicos e catalíticos, é secretada como uma enzima inativa ou zimogênica por células específicas. A interação entre o domínio catalítico íon zinco e o resíduo de cisteína do domínio propeptídico mantém a MMP inativa.

Para detectar MMPs no sobrenadante de cultura de células por eletroforese em gel de zimografia, encha o tanque de eletroforese contendo de gel com dodecil sulfato de sódio ou tampão de corrida contendo SDS.

Carregue o sobrenadante de cultura misturado com tampão de carga, seguido de padrões de proteína, em poços de gel de poliacrilamida, copolimerizado com um substrato proteico específico para MMP.

O SDS, um detergente carregado negativamente, em condições não redutoras, interrompe as interações cisteína-zinco em MMPs e desnatura as proteínas enquanto transmite uma carga negativa.

Realize eletroforese. O campo elétrico faz com que as proteínas carregadas negativamente migrem em direção ao ânodo carregado positivamente, causando a separação de proteínas com base no tamanho.

Após a eletroforese, trate o gel com um tampão de renaturação contendo detergente não iônico. Os detergentes não iônicos substituem o SDS, renaturando proteínas e restaurando parcialmente a atividade da MMP. As MMPs são processadas ainda mais para um estado totalmente ativo.

Incubar em um tampão de desenvolvimento contendo cátions metálicos divalentes essenciais para a atividade de MMP. MMPs ativas, juntamente com cátions, digerem o substrato MMP no gel. Lave o gel para remover os produtos digeridos. Manchar o gel.

As áreas de atividade de MMP, desprovidas de substrato de MMP, aparecem como faixas claras contra um fundo azul escuro de substrato não digerido. Usando software adequado, a intensidade da banda de gel pode ser correlacionada à atividade da MMP.

Antes do início deste protocolo, prepare todas as metaloproteinases da matriz, ou MMPs, adequadamente para manter a função das enzimas. As amostras podem ser usadas imediatamente ou armazenadas a -80 graus Celsius. Aqui, a MMP-2, também conhecida como gelatinase A ou colagenase tipo IV, é usada para demonstrar a visualização da atividade da MMP com zimografia.

Uma vez preparadas as enzimas MMP, obtenha uma bolsa de gel de zimograma de gelatina a 10% contendo um gel dentro de um. Enxágue o com água deionizada. Remova a fita protetora da parte inferior do e o pente da parte superior do gel. Enxágue os poços três vezes com tampão de corrida Tris-Glycine SDS.

Coloque o gel em um aparelho de eletroforese de minicélulas, garantindo que o lado menor do esteja voltado para dentro. Trave o gel no lugar com a cunha de tensão de gel. Encha a câmara superior do aparelho com tampão de tris-glicina SDS acima do nível dos poços e verifique se há vazamentos. Encha também a câmara inferior da configuração de eletroforese em gel com tampão de corrida.

Em seguida, carregue 10 microlitros de marcador molecular de proteína.

Misturar uma quantidade igual da amostra num tampão de carregamento de gel que não contenha agentes redutores. Ao contrário do SDS-PAGE normal, não ferva as amostras e, em vez disso, carregue-as diretamente nos poços do gel, usando pontas de carregamento de gel. Esses poços podem conter até 20 microlitros de volume.

Coloque a tampa na minicélula e conecte os cabos do eletrodo à fonte de alimentação. Ligue a fonte de alimentação e defina o gel para funcionar a 125 volts, constante por 90 minutos. Verifique a formação de pequenas bolhas no fio da câmara inferior, indicando circulação de corrente.

Ao executar o primeiro gel, monitore o progresso da migração a cada 15 minutos, usando o azul de bromofenol incluído no buffer de carregamento como indicador. Para cada gel, prepare 100 mililitros de tampão de renaturalização de zimograma 1X e 200 mililitros de tampão de revelação de zimograma, ambos em água deionizada.

Quando o corante de rastreamento azul de bromofenol atingir o fundo do gel, desligue a fonte de alimentação.

Abra a minicélula e remova o gel. Separe os dois lados do usando uma faca de gel. Corte um canto para marcar a direção do gel. Remova cuidadosamente o gel do e coloque-o em um recipiente com 100 mililitros de tampão de renaturação.

Incube o gel por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.

Remova o tampão de renaturalização e adicione 100 mililitros de tampão de revelação ao gel. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.

Em seguida, remova o tampão de revelação e adicione mais 100 mililitros de tampão de revelação fresco ao gel. Incube o gel durante a noite a 37 graus Celsius.

Após a incubação durante a noite, remova o tampão de revelação e lave o gel incubando-o com água deionizada, sob agitação suave, por 5 minutos em temperatura ambiente. Repita esta lavagem duas vezes.

Coloque o gel em um protetor de folha de plástico e remova as bolhas. Em seguida, escaneie o gel com um fotoscanner para salvar o posicionamento exato das bandas padrão da proteína, pois elas se tornarão pouco visíveis após a coloração do gel.

Manchar o gel adicionando 20 mililitros de SimplyBlue SafeStain ao gel. Incubar o gel durante 1 hora à temperatura ambiente, sob agitação suave.

Remova o SimplyBlue SafeSta, e destrate o gel em 100 mililitros de água deionizada à temperatura ambiente sob agitação suave.

Após 1 hora, substitua por água fresca deionizada e continue a incubar o gel por pelo menos uma hora.