Ensaio de Atividade de Fosfolipase: Um Ensaio de Difusão em Gel para Determinar a Atividade da Fosfolipase em Extrato Bruto de Veneno de Anthopleura dowii

Os fosfolipídios são lipídios complexos contendo grupos fosfato. Essas moléculas são hidrolisadas por uma enzima chamada fosfolipase.

Para realizar o ensaio de atividade da fosfolipase, pegue uma emulsão de gema de ovo rica em fosfolipídios, que atuam como substrato para a enzima. Adicione a gema a uma solução quente de agarose contendo cloreto de sódio, o que aumenta a estabilidade das proteínas da gema durante as etapas subsequentes.

Complemente a mistura com cloreto de cálcio e um corante fluorescente - rodamina. Despeje a mistura em uma placa de Petri. Após a solidificação, os fosfolipídios da gema permanecem homogeneamente distribuídos na matriz do gel de agarose.

Usando um tubo, crie poços adequadamente distanciados no gel. Adicione concentrações variadas de extrato de proteína bruta contendo fosfolipase aos poços. Incubar a placa à temperatura fisiológica.

A fosfolipase do extrato se difunde radialmente no gel. Os íons de cálcio no gel se ligam à fosfolipase, ativando as enzimas. Esta enzima cliva os fosfolipídios, gerando ácidos graxos livres. As moléculas de rodamina no gel formam um complexo com os ácidos graxos liberados.

Após a iluminação com luz ultravioleta, observe o aparecimento de halos fluorescentes ao redor dos poços. O halo confirma a presença de atividade enzimática. Com concentrações mais altas de fosfolipase, as moléculas enzimáticas se difundem ainda mais, aumentando o diâmetro do halo.

Lave um ovo de galinha com SDS a 1% em água destilada e separe a gema da clara em condições estéreis.

Prepare as soluções A, B, C e D. Adicione 500 microlitros de soluções A e C à solução B e 100 microlitros de solução D. Misture-os e despeje 25 mililitros em cada placa de Petri. Aguarde a solidificação da solução em condições estéreis e faça poços de aproximadamente 2 a 3 milímetros de diâmetro, com um tubo fino.

Adicione um total de 20 microlitros de tampão fosfato como controle negativo em um poço e 20 microlitros de uma determinada fosfolipase como controle positivo em outro poço.

Colocar diferentes quantidades da proteína do extracto bruto - 5, 15, 25, 35 e 45 microgramas nos restantes alvéolos, cada um num volume final de 20 microlitros. Incube a 37 graus Celsius por 20 horas.