Ensaio de quiralidade celular de micropadronização em forma de anel: uma técnica in vitro para determinar a quiralidade multicelular com base no alinhamento celular em micropadrões em forma de anel

Para determinar in vitro a quiralidade das células de mamíferos - o viés esquerda-direita das células para se alinhar em uma orientação para a esquerda ou para a direita sob condições confinantes - comece com lâminas revestidas de ouro fabricadas sob medida em uma placa de vários poços contendo meio. As lâminas compreendem micropadrões de ilhas em forma de anel de fibronectina promotora de adesão celular, preenchidas com monocamada automontada resistente à adesão celular.

Em seguida, semeie um volume apropriado de suspensão de células de mamíferos nas lâminas e incuba. As células adsorvem nos micropadrões do anel contendo fibronectina. A monocamada auto-montada circundante evita a fixação de células não específicas fora dos limites do anel.

Substitua a mídia, removendo todas as células soltas, por uma nova mídia. Adicione um medicamento interferente na actina a um conjunto de lâminas e incuba.

As células aderidas proliferam, espalhando-se e assumindo a forma das ilhas de fibronectina subjacentes, enquanto reorganizam suas fibras de actina em resposta aos sinais espaciais, que confinam a monocamada celular, promovendo alinhamento tendencioso.

Agora, trate as lâminas com paraformaldeído para fixação celular. Sob microscopia de contraste de fase, as células nos micropadrões do anel aparecem como regiões escuras com contornos brilhantes alinhados de acordo com seu viés preferencial.

Usando o software, calcule o ângulo de alinhamento de cada célula como o desvio da direção circunferencial do anel. Média para determinar a quiralidade das células de mamíferos. As células tratadas com medicamentos interferentes na actina podem exibir quiralidade reversa.

Antes de semear as células, aqueça o meio e a tripsina em banho-maria, temperado a 37 graus Celsius.

Para uma melhor fixação das células, mergulhe a lâmina padronizada em uma placa de 12 poços contendo meios de cultura e aqueça-a a 37 graus Celsius na incubadora. Uma vez que as células são tripsinizadas, neutralize-as com meios contendo FBS. Pulverize as células a 100 x g por 3 minutos e, em seguida, ressuspenda o pellet celular em meio fresco. Conte as células e dilua a suspensão celular para atingir a concentração de 200.000 células por mililitro.

Adicione 0,5 mililitros da suspensão celular a cada poço contendo uma lâmina de ouro. Agite suavemente a placa algumas vezes para uma semeadura uniforme das células, antes de incubar por 15 minutos para fixação das células. Após 15 minutos, verifique a fixação da célula ao microscópio e, se necessário, incube por mais algum tempo.

Uma vez que as células estejam ligadas, aspire o meio contendo células soltas de cada poço e adicione 1 mililitro de meio de cultura fresco. Cultive as células na incubadora por 24 horas e verifique a confluência para determinar se a quiralidade se formou.

Quando a confluência necessária for alcançada, fixe as células removendo o meio de cultura. Depois de enxaguar com PBS uma vez, adicione a solução de paraformaldeído a 4% à lâmina e incube em temperatura ambiente por 15 minutos, antes de enxaguar novamente com PBS três vezes.

Para adquirir as imagens, use um microscópio de contraste de fase com funcionalidade de câmera e capture cada anel na lâmina em alta resolução.

Para caracterização de quiralidade, baixe os arquivos de código do MATLAB. Adicione a pasta de código e as subpastas ao caminho do MATLAB e abra o arquivo "ROI_selection.m". Na linha 4, altere o diretório para a pasta de dados desejada.

Altere o tamanho da imagem na linha 14, com as duas primeiras figuras representando o tamanho do círculo interno do anel, enquanto as outras duas representam o externo.

Para determinar a região de interesse ou ROI nas imagens de contraste de fase, execute o código MATLAB "ROI_selection.m" m clicando no botão Executar. Arraste manualmente o quadrado de seleção para caber no anel e, em seguida, clique duas vezes na imagem para confirmar a seleção.

Depois de selecionar o ROI de todas as imagens da pasta, um arquivo ".mat" será gerado para armazenar as informações de ROI de cada imagem. Em seguida, abra o arquivo "Analysis_batch.m" e altere o diretório da pasta conforme demonstrado anteriormente. Clique no botão Executar para executar o código "Analysis_batch.m" para determinar a quiralidade de vários padrões de anéis celulares.

Um arquivo "datatoexcel.txt" será gerado, contendo estatísticas circulares para cada anel, bem como o número de anéis no sentido horário, não quiral e anti-horário.